王毅,劉子秋

(貴陽(yáng)市公安司法鑒定中心,貴陽(yáng) 550007)

毛細(xì)管固相微萃取-液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定血漿中5種新型濫用藥物*

王毅,劉子秋

(貴陽(yáng)市公安司法鑒定中心,貴陽(yáng) 550007)

目的 建立毛細(xì)管固相微萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測(cè)定血漿中新型濫用藥物。方法取含藥物成分的血漿樣品1 m L,加入硼砂緩沖液2 mL后吸入注射器中,與內(nèi)壁固定有DB-1701毛細(xì)管柱的不銹鋼針頭連接,置于注射泵,以300μL·min-1流速排出樣品,乙腈50μL洗脫2min,采用UPLC-MS/MS梯度洗脫-正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描測(cè)定洗脫液中藥物成分,并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果血漿中鹽酸可待因、鹽酸曲馬多、地芬諾酯、地西泮、三唑侖等5種新型濫用藥物回收率為69.2%～81.7%,RSD＜10%,檢測(cè)限＜25 ng·mL-1,26例樣品中檢出7例。結(jié)論采用毛細(xì)管固相微萃取方法簡(jiǎn)便,快速,與UPLC-MS/MS技術(shù)結(jié)合可用于血漿中新型濫用藥物的快速篩查。

毛細(xì)管固相微萃取;液質(zhì)聯(lián)用;濫用藥物,新型;血漿

止咳水、鹽酸曲馬多片、復(fù)方地芬諾酯片處方制劑中主要含有可待因、曲馬多、地芬諾酯等精神類藥物成分,近年來(lái)在青少年中濫用的情況越發(fā)嚴(yán)重,首用年齡由16歲降至約14.5歲,合并地西泮、三唑侖使用更易造成依賴,甚至死亡。對(duì)血漿中該類新型濫用藥物的篩查分析已成為法醫(yī)毒物檢驗(yàn)的新關(guān)注點(diǎn)[1]?，F(xiàn)有檢驗(yàn)方法例如液-液提取[2]、固相萃取法[3]所耗時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)試劑用量大、成本高。而毛細(xì)管固相微萃取(in-tube solid-phasemicroextraction,In-tube SPME)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快捷,污染小[4],便于在線聯(lián)用[5-6],在藥物篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。筆者通過(guò)建立In-tube SPME-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯(lián)用法測(cè)定血漿中新型濫用藥物,并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢驗(yàn),以提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UPLC-TQD三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；DB-1、DB-5、DB-1701、HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱(美國(guó)J&W公司)；實(shí)驗(yàn)室注射泵(LSP01-1A,蘭格公司)；20-gauge不銹鋼針頭,魯爾頭進(jìn)樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸可待因、鹽酸曲馬多、地芬諾酯、地西泮、三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品(公安部物證鑒定中心)；內(nèi)標(biāo)為3,4-亞甲二氧甲基苯丙胺(DL-3,4-methylenedioxymethamphetamine,DLMDMA,美國(guó)Aldrich公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Tedia公司)；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo),分別用甲醇配制成1 mg·m L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,然后稀釋配制成20μg·m L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 樣品溶液制備 取空白血漿,添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制得藥物濃度為100 ng·mL-1的混標(biāo)血漿樣品；In-tube SPME裝置的不銹鋼針頭內(nèi)表面依次用1 mol·L-1鹽酸、乙腈清洗。截取10 cm毛細(xì)管柱,表面涂布環(huán)氧膠,放入不銹鋼管內(nèi),制得In-tube SPME針頭,晾干4 h后備用。

萃取:取血漿1 m L,加入緩沖液2 mL,漩渦混勻,離心,注射器抽取上清液后更換In-tube SPME針頭,置于注射泵以一定流速排出樣品,完成萃取過(guò)程。

解吸:用水1 m L洗去In-tube SPME針頭中殘留樣品后,針頭換至含乙腈50μL的魯爾頭進(jìn)樣器上,置于注射泵以一定流速排出乙腈,使目標(biāo)物從固定相中洗脫出來(lái),完成解吸。

2.3 測(cè)定條件 Waters UPLC-TQD；色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm),柱溫:30℃,流動(dòng)相:乙腈(A相)-0.1%甲酸(B相)梯度洗脫,梯度洗脫程序:A相5%保持2 min,從5%經(jīng)15 min升至25%,再?gòu)?5%經(jīng)3 min升至100%,保持1.5 min；流速:0.3mL·min-1；進(jìn)樣體積5μL。質(zhì)譜條件:采用電噴霧電離源,毛細(xì)管電離電壓:3 kV,離子源溫度: 120℃；噴霧氣與反吹氣:氮?dú)?去溶劑氣流速: 650 L·h-1,多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)。

2.4 萃取條件優(yōu)化

2.4.1 毛細(xì)管萃取柱的選擇 不同填料對(duì)血漿中藥物成分的萃取能力不同,實(shí)驗(yàn)在一定條件下對(duì)DB-1、DB-5、DB-1701、HP-INNOWax毛細(xì)管柱的萃取效率進(jìn)行考察,結(jié)果(圖1A)表明DB-1701色譜柱表現(xiàn)出最優(yōu)的效果。

2.4.2 基底pH影響 實(shí)驗(yàn)考察了5種pH(間隔1.5)基底對(duì)樣品萃取效率影響(pH＞9時(shí)環(huán)氧膠易漏液,不作考慮)。結(jié)果(圖1B)表明,在pH8.5基底環(huán)境下效率最佳。

2.4.3 萃取流速的考察 為考察不同流速對(duì)萃取效率的影響,實(shí)驗(yàn)采用100,300,500μL·min-13個(gè)流速進(jìn)行考察,結(jié)果(圖1C)顯示實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)流速變化對(duì)萃取效率的影響并不顯著,實(shí)驗(yàn)選用300μL·min-1作為萃取流速。

A.毛細(xì)管萃取柱的選擇;B.pH優(yōu)化;C.流速優(yōu)化;D.解吸時(shí)間優(yōu)化圖1 毛細(xì)管固相微萃取條件優(yōu)化A.the optimization of capillary-column；B.optimization of sample pH on extraction efficiency；C.optimization of flow rate；D. optimization of desorption timeFig.1 Optim ization of extract condition of in-tube SPME

2.4.4 解吸時(shí)間的考察 In-tube SPME僅使用數(shù)微升有機(jī)溶劑即可完成萃取,實(shí)驗(yàn)采用50μL乙 腈在5個(gè)不同時(shí)間段對(duì)解吸效率進(jìn)行考察,曲線表明(峰面積按比例縮小),在1～2 min時(shí)提取效率大幅增加,但在2 min后無(wú)明顯變化(圖1D)。

2.5 專屬性 取空白血500μL,按“2.2”項(xiàng)操作,獲得空白樣品多重反應(yīng)檢測(cè)(multiple reactionmonitoring, MRM)提取色譜圖2A；取混標(biāo)血漿樣品,同法操作獲得混標(biāo)添加MRM提取色譜圖2B。結(jié)果表明血中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)成分測(cè)定。

A.空白溶液;B.樣品溶液圖2 兩種溶液的In-tube SPME-UPLC-MS/MS色譜圖A.blank solution；B.sample solutionFig.2 Chrom atogram of in-tube SPME-UPLC-MS/MS for two k inds of solutions

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取混標(biāo)血漿樣品(n=6),按“2.2”項(xiàng)操作,獲得相應(yīng)峰面積(A樣)；另取全血樣品,同法操作,獲得空白基質(zhì)溶液,加入相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)樣分析獲得相應(yīng)峰面積(B樣)；以A樣與B樣峰面積之比計(jì)算提取回收率,結(jié)果見(jiàn)表1,藥物回收率69.2%～81.7%。

2.7 方法檢測(cè)限 配制質(zhì)量濃度逐漸降低的系列人血樣品,按“2.2”項(xiàng)方法操作后進(jìn)樣分析,記錄峰面積,測(cè)得藥物檢測(cè)限(S/N=3),結(jié)果顯示(表1)均低于國(guó)際法庭毒理協(xié)會(huì)報(bào)告數(shù)據(jù)。

2.8 重復(fù)性 取混標(biāo)血漿樣品(n=6),按“2.2”項(xiàng)下操作,測(cè)定峰面積并計(jì)算,結(jié)果RSD＜10%,說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.9 樣品測(cè)定 對(duì)26例非正常死亡青少年血漿進(jìn)行濫用藥物篩查,檢出7例(表2),其中3例在服用藥物后1 h內(nèi)發(fā)生死亡,其余4例均發(fā)生在1～3 h,血漿篩查結(jié)果表明混合服用藥物可能是造成迅速死亡的直接原因。

3 討論

色譜柱常用內(nèi)徑分別為0.25,0.32,0.53 mm,內(nèi)部容積分別為4.91,8.04,20.58μL,選用容積較小的毛細(xì)管在一定流速下可以減少管壁液膜層厚度,在非平衡動(dòng)態(tài)吸附方式下對(duì)萃取富集和解吸洗脫均有良好效果；且固定相萃取量與血漿中目標(biāo)物濃度存在線性關(guān)系,與血漿體積無(wú)關(guān),則固定相厚度增加,萃取量增加,但當(dāng)厚度接近1μm時(shí),可觀察到殘留增加,選用膜厚0.5μm為佳。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)于萃取流速考察與FAN等[7]的研究結(jié)果相反?？紤]雖然增加流速,導(dǎo)致柱體內(nèi)“對(duì)流”效應(yīng)上升,從而使血漿通過(guò)管體時(shí)湍流雷諾數(shù)加大,但不同大小分子的擴(kuò)散速度不同,此時(shí)萃取效率僅與液膜表面作用力和液膜下固定相表面吸附力有關(guān),因此流速增大未改變萃取效率。另外,500μL·min-1產(chǎn)生明顯氣泡,故實(shí)驗(yàn)選用300μL·min-1作為萃取流速。

受毛細(xì)管內(nèi)壁填料絕對(duì)量影響,In-tube SPME不具備良好的線性關(guān)系,目前研究多為定性篩查使用[8],實(shí)驗(yàn)未對(duì)線性進(jìn)行考察。且當(dāng)樣本濃度＞200 ng·mL-1時(shí)可觀察到地芬諾酯、地西泮、三唑侖發(fā)生明顯“泄漏”,采用100 ng·mL-1濃度進(jìn)行回收率考察等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容符合國(guó)際毒理學(xué)家協(xié)會(huì)(The International Association of Forensic Toxicologists,TIAFT)要求。

表1 血漿中藥物回收率、相對(duì)保留時(shí)間及檢測(cè)限Tab.1 Recoveries of drugs in p lasma and their relative retention tim e(RRT)and LOD n=6

表2 7例非正常死亡青少年血漿樣品篩查結(jié)果Tab.2 Determ ination result of p lasma sam p le from seven youngsters of abnormal death

In-tube SPME技術(shù)近來(lái)發(fā)展很快,結(jié)合UPLC-MS/ MS對(duì)血漿中新型濫用藥物進(jìn)行篩查,相比其他方法[2],環(huán)境友好,操作簡(jiǎn)便,易自動(dòng)化,且方法回收率及重復(fù)性良好[9],可運(yùn)用于實(shí)際案例篩查分析。在將來(lái)的工作中采用該方法進(jìn)一步擴(kuò)大藥物篩查范圍,將成為法醫(yī)毒物檢驗(yàn)的常用手段。

[1] 張銳敏.我國(guó)藥物濫用防治工作現(xiàn)狀分析及未來(lái)策略思考[J].中國(guó)藥物濫用防治雜志,2013,19(2):68-71.

[2] 沈敏,向平,沈保華,等.LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)篩選分析血液中132種毒藥物[J].中國(guó)司法鑒定,2006,22(1): 14-20.

[3] 楊志勇,王占良,張建麗.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速篩查尿樣中麻醉劑類藥物[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2012,33(3):161-167.

[4] YAN X,WU D,PENG H,et al.Array capillary in-tube solidphasemicroextraction:a rapid preparation technique forwater samples[J].JChroma A,2012,1244(1):69-76.

[5] YU QW,WANG X,MA Q,et al.Automated analysis of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human plasma and water samples by in-tube solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography-mass spectrometry based on a poly(4-vinylpyridine-co-ethylene dimethacrylate)monolith[J].AnalMethods,2011,4(6):1538-1545.

[6] MOLINER M Y,PRIMA G H,RIBERA A,et al.Magnetic in tube solid phase microextraction[J].Anal Chem,2012,84 (16):7233-7240.

[7] FAN Y,FENG Y Q,DA S L,et al.Poly(methacrylic acidethylene glycol dimethacrylate)monolith in-tube solid phase m icroextraction coupled to high performance liquid chromatography and analysis of amphetamines in urine samples[J].JChroma A,2005,1074(1):9-16.

[8] KATAOKA H.Automated sample preparation using in-tube solid-phasemicroextraction and its application-a review[J]. Anal Bioanal Chem,2002,373(1-2):31-45.

[9] 竇志華,羅琳,安莉萍,等.五味子乙醇提取物的UPLCMS/MS分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(2):239-241.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.007

Determination of 5 New Abused Drugs in Plasma by In-tube Solid-phase Microextraction Coupled to Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Yi,LIU Zi-qiu
(Judicial Expertise Center ofGuiyang Public Security Bureau,Guiyang 550007,China)

ObjectiveTo establish a method for determination of new abused drugs in plasma by using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)combined with in-tube solid-phase microextraction.Methods2mL of borax bufferwasadded to1mLofplasmawith drugs.Then,themixturewaswithdrawn into a syringe connected to a stainless steel needle welded with DB-1701 capillary column.50μL acetonitrile was used as elution solventat the flow rate of 300μL·min-1for 2min.Subsequently,the drugs on elutewere determined by using UPLC-MS/MS in positivemodewithmultiple reactionmonitoring(MRM)to determine drug concentration in human plasma samples.ResultsThe recoveries rates of the five abused drugs(codeine hydrochloride,tramadol,diphenoxylate hydrochloride,diazepam,and triazolam)in plasma were between 69.2%-81.7%with the RSDs less than 10%.LODs of the drugs were less than 25 ng·mL-1.Seven out of the 26 plasma samples were determ ined positive.ConclusionThe in-tube SPME method coupled to UPLC-MS/MS is simple,rapid,and environmental friendly,which is suitable for the the rapid screening of the new abused drugs.

In-tube solid-phase microextraction;Liquid chromatography tandem mass spectrometry;Abused drugs, new type;Plasma

R971;R969.1

A

1004-0781(2014)05-0575-04

2013-07-10

2013-09-21

*貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目:筑科合同[2012103]98號(hào)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目[(2011)23號(hào)]

王毅(1982-),男,湖南長(zhǎng)沙人,工程師,碩士,從事法醫(yī)毒物檢驗(yàn)工作。電話:0851-6797740,E-mail:18712664@qq.com。