龔志剛,丁世芳,姜其鈞,付文波

(1.南方醫(yī)科大學研究生院,廣州 510515;2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430070)

蝦青素保護線粒體和抑制氧化應激誘導的內(nèi)皮祖細胞凋亡*

龔志剛1,2,丁世芳2,姜其鈞2,付文波2

(1.南方醫(yī)科大學研究生院,廣州 510515;2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430070)

目的 探討蝦青素對體外氧化應激誘導人外周血內(nèi)皮祖細胞凋亡的影響及其機制。方法體外培養(yǎng)人外周血單核細胞源的內(nèi)皮祖細胞,分為正常對照組、模型組(給予叔丁基過氧化氫100μmol·L-1)、預處理組(給予叔丁基過氧化氫100μmol·L-1+蝦青素0.1,1.0,10.0 nmol·L-1預處理24 h)。噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞檢測細胞凋亡率;2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;比色法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)活性;陽離子脂質JC-1法測定線粒體膜電位。結果MTT檢測發(fā)現(xiàn),隨著蝦青素濃度的增加,內(nèi)皮祖細胞的存活率也增加。與模型組[(48.5±4.3)%]比較,蝦青素+叔丁基過氧化氫組細胞存活率明顯升高[(57.6±8.2)%,(77.6±7.5)%,和(85.3±6.1)%,P＜0.05];DAPI染細胞檢測發(fā)現(xiàn),預處理組凋亡細胞明顯減少,模型組凋亡小體形成率(27.8±3.2)%,3個預處理組凋亡小體形成率分別為[(20.4±2.9)%,(14.9±1.7)%和(7.8±0.7)%,P＜0.05];caspase-3活性檢測表明,與模型組(0.345±0.018)比較,預處理組活性隨蝦青素劑量增大而依次降低[(0.291±0.013),(0.209±0.004),(0.169±0.013),P＜0.05];DCHF-DA分子探針檢測細胞內(nèi)ROS發(fā)現(xiàn),與模型組比較,預處理組細胞內(nèi)ROS水平呈劑量依賴性降低,熒光強度明顯減弱。JC-1法線粒體膜電位檢測顯示,與模型組比較,預處理組線粒體膜電位丟失被明顯抑制。結論蝦青素通過減少細胞內(nèi)ROS,保護線粒體膜電位,下調(diào)caspase-3活性,最終起到抗氧化應激誘導的EPCs凋亡。

蝦青素;氧化應激;內(nèi)皮祖細胞;細胞凋亡;線粒體膜電位

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在外周循環(huán)血中的數(shù)量與功能是促進再內(nèi)皮化,使其完整性得以維持的重要因素[1]。研究表明EPCs對氧化應激損傷敏感[2];活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高是冠心病、缺血-再灌注損傷,以及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療損傷的共同特征[3],由此構成的引起內(nèi)皮祖細胞損傷和凋亡的血管整體/局部氧化應激微環(huán)境,可能是患者外周血EPCs的數(shù)量及功能明顯減少/受損的直接原因[4]。因此,探尋增強EPCs抗氧化應激能力,改善其數(shù)量和功能,可能是血管損傷后再內(nèi)皮化治療藥物作用的新靶點[5]。蝦青素(astaxanthin,ASX)對氧化應激引起的多種細胞如人神經(jīng)干細胞[6],臍靜脈內(nèi)皮細胞[7],腎小球系膜細胞[8],視網(wǎng)膜細胞[9]等的凋亡具有顯著保護作用。但ASX對EPCs是否具有抗氧化應激損傷引起凋亡的作用,目前筆者尚未見報道。筆者在本研究中利用體外培養(yǎng)人外周血單核細胞源的EPCs,叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)制作氧化應激損傷模型,觀察并探討ASX對tBHP誘導EPCs凋亡的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 Histopaque1077淋巴細胞分離液(美國Amersham Biosciences公司);M199培養(yǎng)液、胎牛血清、細胞培養(yǎng)板(美國Gibico公司);胰酶(上海博光生物技術公司);硫氰酸熒光(fluorescein isothocyanate,FITC)標記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)、人纖維連接蛋白、ASX、叔丁基過氧化氫(tBHP)、四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)均購于美國Sigma公司;乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)購于美國Molecular Probe公司;重組人血管內(nèi)皮生長因子(rh-VEGF165)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-b-FGF)均購于英國Pepro Tech公司;PE標記鼠抗人CD133單克隆抗體(德國Miltenyi Biotec公司);FITC標記鼠抗人CD34單克隆抗體(美國Southern Biotech公司);PE標記鼠抗人VEGF-R2單克隆抗體、Caspases活性檢測試劑盒(美國R&D System公司);ROS檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、DAPIApoptosis Detection試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 人EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取健康志愿者外周血,以1∶2比例磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)稀釋后,緩慢移至Histopaque1077淋巴細胞分離液上方,400×g室溫離心30 min,分離出中間單個核細胞層。將分離好的單核細胞用含有10% PBS、20%胎牛血清、rh-VEGF10 ng·mL-1、rh-b-FGF 10 ng·mL-1的M199培養(yǎng)液稀釋成5×106·m L-1,放置于37℃,5%二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng);培養(yǎng)到第4天,用PBS洗去非貼壁細胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);取第7天的細胞,加入2.4 mg·L-1DiI-Ac-LDL和10 mg·L-1FITC-UEA-I于37℃孵育1 h后,用熒光顯微鏡檢測雙染色陽性細胞百分比。另取第7天的細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,分別加入10 mg·L-1PE標記的VEGF-R2單克隆抗體、10 mg·L-1PE標記的CD133單克隆抗體、10 mg·L-1FITC標記的CD34抗體,4℃孵育30 min后,上流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達率。于第7天,加入無血清的培養(yǎng)液同步化細胞24 h,進行后續(xù)實驗。

1.3 人EPCs的tBHP損傷模型的建立 同步化后的EPCs用0.25%胰酶消化,以每孔1×103的密度接種于96孔板,分別加入濃度為30,60,120,240μmol·L-1的tBHP干預6 h,加入MTT(5 g·L-1)10μL在37℃孵育4 h后吸去上清液,加入二甲亞砜100μL,振蕩10 min溶解結晶,上酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值。根據(jù)細胞存活情況選擇合適的tBHP作用濃度用于后續(xù)干預實驗。細胞存活率(%)=(模型組A值/對照組A值)×100%。

1.4 ASX對正常和損傷細胞存活率的影響 待細胞長到鋪滿板底70%～80%時,預處理組加入終濃度分別為0.1,1.0,10.0 nmol·L-1的ASX溶液于37℃孵育24 h后,換為無血清MEM(minimum essential medium),再加終濃度為100μmol·L-1的tBHP溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,MTT法檢測細胞存活率。

1.5 細胞凋亡率的測定 藥物處理好的細胞除去培養(yǎng)基,用PBS洗2次,binding buffer重懸并調(diào)整細胞數(shù)為1×106·mL-1,然后用4%多聚甲醛固定15 min,用DAPI(2.5μg·mL-1)染核20 min,在熒光顯微鏡下攝細胞圖像,觀察細胞核形態(tài)。熒光顯微鏡下,活細胞核呈彌散均勻熒光,細胞凋亡時,細胞核或細胞質內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光,核出現(xiàn)不同程度的固縮,可見DNA熒光碎片(凋亡小體)。分別選取5個視野,并計數(shù)細胞100個,計算細胞凋亡小體形成率,細胞凋亡小體形成率(%)=凋亡小體細胞數(shù)/總的細胞數(shù)× 100%,取5次結果的平均值來評價細胞凋亡率。

1.6 測定caspase-3活性 按caspase-3 Colorimeric Assay Kit說明書進行。細胞1×106個溶于細胞溶解液50μL后,加入2×反應緩沖液50μL和酶底物(DEVD-pNA)5μL,37℃孵育1 h,用酶標儀在波長405 nm下測A值。

1.7 細胞內(nèi)ROS水平測定 采用DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS水平。96孔板,經(jīng)藥物處理后的各組EPCs,用10μmol·L-1DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)液于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,用無血清細胞培養(yǎng)液洗3次以去除探針,酶標儀檢測DCF,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm。DCF相對熒光強度(%)=處理組的熒光值/對照組的熒光值×100%。

1.8 細胞線粒體膜電位的測定 采用JC-1法。接種于96孔板,經(jīng)藥物處理后的各組EPCs,除去培養(yǎng)基, PBS洗2次,滴加JC-1工作液100μL,37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)20 min,1×Incubation Buffer洗2次,于熒光顯微鏡下觀察。JC-1是一種陽離子脂質熒光染料,作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種狀態(tài),低濃度時以單體形式存在,高濃度時以多聚體形式存在,兩者的發(fā)射光譜不同,JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi),正常細胞線粒體的膜電位(ΔΨ)具有極性,JC-1依賴于ΔΨ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi),并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體,多聚體發(fā)射光為紅色熒光;而在線粒體膜通透性改變,線粒體膜電位去極化時,JC-1從線粒體內(nèi)釋放,紅光強度減弱,以單體的形式存在于胞質內(nèi)發(fā)綠色熒光,根據(jù)這一特征檢測線粒體膜電位的變化。

1.9 統(tǒng)計學方法 用SPSS13.0版統(tǒng)計分析軟件進行分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析及t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EPCs的形態(tài)與鑒定 EPCs體外培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)集落,4 d后多數(shù)集落已經(jīng)形成,于第8天后加入DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色,其中90%細胞吞噬DiI-Ac-LDL(熒光顯微鏡下呈紅色),及FITC-UEA-I (熒光顯微鏡下呈綠色)染色陽性。采用PE標記的鼠抗人CD133,FITC標記的鼠抗人CD34以及PE標記的鼠抗人VEGF-R2抗體于流式細胞儀檢測細胞表面標志,結果顯示CD133,CD34及VEGF-R2陽性率分別為(89.5±5.3)%,(66.3±6.3)%和(93.1±8.3)%。證實所分離培養(yǎng)的細胞為EPCs,見圖1。

A.DiI-Ac-LDL染色;B.FITC-UEA-I染色;C.DiI-Ac-LDL+FITC-UEA-I染色圖1 EPCs熒光染色鑒定圖A.DiI-Ac-LDL staining;B.FITC-UEA-Istaining;C.DiI-Ac-LDL+FITC-UEA-IstainingFig.1 Fluorescent staining on EPCs

2.2 tBHP損傷EPCs模型的建立 MTT檢測結果顯示不同濃度tBHP作用EPCs 6 h后,細胞存活率表現(xiàn)為隨藥物濃度增加而降低的劑量依賴關系。當tBHP濃度在30μmol·L-1時,細胞存活率為(83.6±10.1)%, 60μmol·L-1時為(65.1±8.8)%,120μmol·L-1時為(34.7±13.2)%,至最大濃度240μmol·L-1時,細胞大部分死亡,細胞存活率為(6.3±4.6)%,與對照組(100%)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,n=6)。當tBHP濃度約為100μmol·L-1時,細胞存活率(48.5± 4.3)%(P＜0.05,n=6),約維持在50%,后續(xù)實驗選擇該條件建立tBHP誘導EPCs的氧化損傷模型。見圖2。

2.3 ASX對tBHP誘導的內(nèi)皮祖細胞存活率下降的影響 MTT結果顯示,預實驗中給予濃度0.1,1.0, 10.0 nmol·L-1的ASX對EPCs的存活率沒有影響。與模型組比較,各實驗濃度的ASX呈劑量依賴性提高細胞存活率,當ASX的濃度達到10 nmol·L-1時,細胞存活率從(57.6±8.2)%升高至(85.3±6.1)%(P＜0.05,n=6),顯著提高EPCs存活率。

2.4 ASX對tBHP誘導EPCs凋亡的影響 應用DAPI染細胞檢測ASX對tBHP引起EPCs凋亡的影響。tBHP 100μmol·L-1處理EPCs 6 h后,細胞出現(xiàn)典型的凋亡核形態(tài)學改變,與對照組比較,細胞染色質濃縮,核固縮明顯,凋亡小體數(shù)目顯著增加,ASX預處理24 h后,可顯著改善細胞凋亡狀況,隨著作用濃度的增加,作用逐漸增強,ASX濃度在10.0 nmol·L-1時,改善最為顯著。經(jīng)過凋亡小體計算統(tǒng)計,正常對照組凋亡小體形成率為(4.8±0.7)%,100μmol·L-1tBHP損傷6 h組凋亡小體形成率(27.8±3.2)%,與正常對照組比較明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,n=6), ASX在0.1,1.0,10.0 nmol·L-1預處理24 h后再加100μmol·L-1tBHP處理6 h,凋亡小體形成率分別為(20.4±2.9)%,(14.9±1.7)%和(7.8±0.7)%(P＜0.05,n=6),可見ASX對tBHP誘導的細胞凋亡具有明顯的保護作用,見圖3。

2.5 ASX對tBHP誘導EPCs caspase-3活性的影響應用紫外分光光度法檢測EPCs caspase-3活性,結果顯示:與正常對照組(0.096±0.014)比較,模型組caspase-3活性(0.345±0.018)顯著升高(P＜0.05,n= 6);而經(jīng)ASX預處理24 h后,與模型組比較,隨著ASX劑量從0.1,1.0,10.0 nmol·L-1增加而caspase-3活性依次下降[(0.291±0.013),(0.291±0.013),(0.169± 0.013),P＜0.05,n=6],提示ASX可通過調(diào)節(jié)caspase-3活性抑制tBHP誘導的EPCs細胞凋亡。

A.對照組;B.模型組;C.預處理組圖2 3組內(nèi)皮祖細胞存活檢測A.control group;B.model group;C.pretreatment groupFig.2 Detection on cell viability of three groups of EPCs

A.對照組;B.模型組;C.預處理組圖3 3組內(nèi)皮祖細胞凋亡的檢測A.control group;B.model group;C.pretreatment groupFig.3 Detection on cell apoptosis of three groups of EPCs

2.6 ASX對細胞內(nèi)ROS的影響 tBHP滲透進入細胞,迅速轉化為叔丁氧基,并進而促進細胞內(nèi)ROS的形成。DCHF-DA是檢測細胞內(nèi)ROS的分子探針,其本身無熒光,當它進入細胞與細胞內(nèi)ROS結合時,產(chǎn)生一種熒光物質DCF,DCF的熒光強度反映細胞內(nèi)ROS水平。本實驗檢測結果顯示,100μmol·L-1tBHP損傷組,EPC細胞內(nèi)ROS水平顯著增加,熒光強度增大;而經(jīng)ASX(0.1,1.0,10.0 nmol·L-1)預孵育組, EPCs細胞內(nèi)ROS水平呈劑量依賴性降低,ASX濃度在10 nmol·L-1時,ROS水平降低最為顯著,熒光強度較損傷模型組明顯減弱,見圖4。

2.7 EPCs線粒體膜電位檢測 本實驗熒光顯微鏡下觀察結果顯示正常對照組為黃綠色,模型組線粒體膜電位丟失,綠色熒光強度變強,而經(jīng)10 nmol·L-1ASX預處理24 h后,其線粒體膜電位丟失得以明顯抑制,呈現(xiàn)黃綠素熒光,但較對照組黃綠色稍偏綠;說明ASX能抑制tBHP引起的EPCs線粒體膜電位去極化,從而提高線粒體膜電位水平,進而對線粒體膜電位丟失促發(fā)的EPCs凋亡具有一定的保護作用,見圖5。

3 討論

ROS是細胞凋亡中的第二信使[10]。研究證實,氧化還原失衡引發(fā)的ROS過度升高(氧化應激)可加重內(nèi)皮祖細胞凋亡和損傷,造成其數(shù)量和功能下降,嚴重影響血管內(nèi)皮修復,引起再內(nèi)皮化不全或延遲,導致臨床心血管不良事件的發(fā)生。

ASX是一種酮式類胡蘿卜素,源自雨生紅球藻類受到較長時間環(huán)境脅迫時,細胞內(nèi)產(chǎn)生的一種抵御不良環(huán)境的長期分子機制,具有多種生物活性,其中最重要的是其極高的抗氧化活性,可應對細胞內(nèi)氧化應激造成的損傷,使細胞渡過難關[11],tBHP是用于構建細胞氧化損傷的常用試劑,其化學性質與過氧化氫(H2O2)相似,但更穩(wěn)定,不易降解。tBHP能模擬氧化應激損傷,直接破壞膜結構,最終導致細胞或線粒體膜的破壞[12]。

A.對照組;B.模型組;C.預處理組圖4 3組內(nèi)皮祖細胞內(nèi)ROS的檢測A.control group;B.model group;C.pretreatment groupFig.4 Detection on ROS in three groups of EPCs

A.對照組;B.模型組;C.預處理組圖5 3組內(nèi)皮祖細胞線粒體膜電位的檢測A.control group;B.model group;C.pretreatment groupFig.5 Detection on mitochondrialmembrane potential in three groups of EPCs

細胞凋亡是多基因、多種分子參與的復雜生命過程。研究發(fā)現(xiàn),caspase-3是細胞凋亡發(fā)生和調(diào)控機制中的重要分子,是凋亡途徑下游進行底物酶解的關鍵蛋白酶,caspase-3的激活是凋亡發(fā)生的最早期事件,它對染色質固縮、DNA片段化起重要的執(zhí)行作用[13]。本研究通過DAPI檢測發(fā)現(xiàn)tBHP可明顯的引起內(nèi)皮祖細胞的凋亡,單純ASX對內(nèi)皮祖細胞無損傷作用,ASX對tBHP誘導的內(nèi)皮祖細胞凋亡具有明顯的保護作用。在ASX抑制EPCs的凋亡中發(fā)現(xiàn)ASX對caspase-3的活性有下調(diào)效應,在10.0 nmol·L-1水平能顯著抑制其激活。

研究發(fā)現(xiàn)線粒體在細胞凋亡過程中起著樞紐作用,線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應中的早期表現(xiàn),線粒體膜電位一旦破壞,可導致線粒體外膜的破裂,各種凋亡因子會隨之釋放,導致細胞凋亡的發(fā)生[14]。本實驗發(fā)現(xiàn),tBHP損傷組細胞線粒體膜電位明顯低于空白對照組,而ASX保護組的細胞線粒體膜電位較損傷組有明顯的提高,可見tBHP誘導的氧化應激損傷降低了EPCs線粒體膜電位,啟動了線粒體途徑細胞凋亡,而ASX能明顯提高EPCs線粒體膜電位,抑制tBHP誘導的線粒體途徑細胞凋亡。

綜上所述,本研究顯示ASX通過減少細胞內(nèi)ROS,保護線粒體膜電位,下調(diào)caspase-3活性,最終起到抗氧化應激誘導的EPCs凋亡。本研究為ASX抗氧化應激損傷,改善EPCs數(shù)量和功能,促進損傷血管再內(nèi)皮化提供了實驗依據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.005

Astaxanthin Inhibits Endothelial Progenitor Cell Apoptosis Induced by Oxidative Stress via Mitochondria-targeted Protective Mechanism

GONG Zhi-gang1,2,DING Shi-fang2,JIANG Qi-jun2,FU Wen-bo2
(1.Graduate School of Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.Department of Cardiology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo investigate the effect of astaxanthin(ASX)on endothelial progenitor cells(EPCs)injury induced by oxidative stressin vitroand to explore its underlyingmechanism.MethodsCultured EPCs isolated from peripheral blood were randomly divided into5 groups:normal control,model group[tert-butyl hydroperoxide(tBHP)100μmol·L-1],and ASX+tBHP groups(the cellswere preconditioned with ASX 0.1,1.0,and 10.0 nmol·L-1,respectively).The cell viability was measured by MT Tmethod.The level of reactive oxygen species(ROS)was determined by DCFH-DA method.The changes of mitochondrialmembrane potential(MMP)and apoptosis ratio were detected by JC-1 method and DA PImethod,respectively. caspase-3 activity changes of EPCs were detected.ResultsThe cell viability of EPCs was improved with the increasing concentration of ASX.Compared with themodel group[(48.5±4.3)%],0.1,1.0,10.0 nmol·L-1ASX significantly increased the cell viabilities[(57.6±8.2)%,(77.6±7.5)%,and(85.3±6.1)%,P＜0.05].The results of DAPIstaining revealed that ASX pretreatment could significantly reduce the apoptotic rate of EPCs.The apoptotic rate of the model group was(27.8± 3.2)%,while that of ASX+tBHP groupswas[(20.4±2.9)%,(14.9±1.7)%,and(7.8±0.7)%,P＜0.05],respectively.The data from caspase-3 activity assay indicated that ASX precondition could also remarkably decrease the caspase-3 activity forEPCs.The caspase-3 activity of the model group was(0.345±0.018),while that of the ASX+tBHP group were[(0.291± 0.013),(0.209±0.004),and(0.169±0.013),P＜0.05],respectively.In addition,treatmentwith tBHP resulted in an increase of DCF fluorescence,while ASX precondition could decrease the DCF fluorescence,which suggested the accumulation of intercellular ROS for EPCs.Injury of michondrialmembrane resulted in the loss of mitochondrial membrane potential(MMP). The MMP detected by JC-1 method revealed that compared with model group,pretreatment of ASX inversed the reduction of MMP.ConclusionAstaxanthin inhibits endothelial progenitor cell apoptosis induced by oxidative stress through inhibiting ROS production,improving themitochondrial function and down-regulating caspase-3 activity.

Astaxanthin;Oxidative stress;Endothelial progenitor cell;Cell apoptosis;Mitochondrialmembrane potential

R966

A

1004-0781(2014)06-0712-06

2013-10-03

2013-12-18

*湖北省自然科學基金項目(2012FFB06803)

龔志剛(1971-),男,湖北隨州人,副主任醫(yī)師,博士,從事心內(nèi)科臨床工作。電話:(0)13397199595,E-mail:13397199595@189.cn。

丁世芳(1957-),女,山東招遠人,主任醫(yī)師,教授,從事心內(nèi)科臨床研究工作。電話:027-68879415,E-mail:dingshifangmd@yahoo.com.cn。