雷章,盧宏達,董克臣,盧馳,陳衛(wèi)群,袁靜萍,3,孔慶志

(1.武漢市中心醫(yī)院腫瘤科,武漢 430014;2.武漢市腫瘤研究所,武漢 430014;3.武漢市中心醫(yī)院病理科,武漢 430014)

連花清瘟膠囊抑制急性放射性肺損傷大鼠MCP-1的表達與效應(yīng)*

雷章1,2,盧宏達1,2,董克臣1,2,盧馳1,2,陳衛(wèi)群2,袁靜萍2,3,孔慶志1,2

(1.武漢市中心醫(yī)院腫瘤科,武漢 430014;2.武漢市腫瘤研究所,武漢 430014;3.武漢市中心醫(yī)院病理科,武漢 430014)

目的 研究連花清瘟膠囊對大鼠急性放射性肺損傷的抑制作用及可能機制。方法將大鼠隨機分為對照組、照射組和照射加連花清瘟組,對照組和照射組給予0.9%氯化鈉溶液,照射加連花清瘟組給予連花清瘟0.9%氯化鈉溶液。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察連花清瘟膠囊對大鼠急性放射性肺損傷肺組織的影響;定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)與酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分別檢測肺組織與血清白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)含量;免疫組化法檢測肺組織中巨噬細胞的數(shù)量。結(jié)果對照組、照射組及照射加連花清瘟組肺組織IL-6 mRNA相對表達水平分別為(0.002 1±0.000 20),(0.006 6±0.000 32),(0.003 9±0.000 22),TNF-α mRNA相對表達水平分別為(0.003 7±0.000 16),(0.007 4±0.000 33),(0.005 5±0.000 24),MCP-1 mRNA相對表達水平分別為(0.001 4± 0.000 15),(0.005 4±0.000 72),(0.003 2±0.000 17);3組血清IL-6濃度分別為(35.2±10.9),(111.8±26.1),(68.2±15.2) pg·mL-1,TNF-α濃度分別為(229.3±28.5),(837.5±57.6),(566.9±39.8)pg·mL-1,MCP-1濃度分別為(96.85±8.20), (314.53±12.76),(191.32±10.97),每個高倍鏡視野下巨噬細胞數(shù)目分別為(59.5±4.3),(503.9±25.8),(106.2±12.6)。連花清瘟膠囊能夠減輕急性放射性肺損傷大鼠肺組織炎癥反應(yīng),抑制巨噬細胞在肺組織中的聚集,減少炎癥因子IL-6、TNF-α表達,降低MCP-1在大鼠肺組織與血清的含量,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論連花清瘟膠囊通過抑制MCP-1表達,從而抑制巨噬細胞向急性放射性肺損傷大鼠肺組織中的聚集,進而減輕炎癥反應(yīng)。

連花清瘟膠囊;損傷,肺,急性/放射性;大鼠;單核細胞趨化蛋白1

放射治療是胸部腫瘤的主要治療手段之一,在肺癌[1]、乳腺癌[2]、食管癌[3]等高發(fā)腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用,并且其療效在一定范圍內(nèi)與放療劑量呈正相關(guān)[4]。肺是胸部放療的主要危及器官,由于其對射線較敏感,放射性肺損傷在一定程度上限制了高劑量放療在胸部腫瘤中的應(yīng)用[5]。目前臨床主要采用大劑量糖皮質(zhì)激素、輻射防護藥阿米福汀及抗氧化藥等防治放射性肺損傷,但療效仍有待進一步提高[6]。巨噬細胞是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞,單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)是其主要的趨化因子[7]。筆者在本實驗中將連花清瘟膠囊用于治療大鼠急性放射性肺損傷,發(fā)現(xiàn)連花清瘟膠囊通過抑制MCP-1的表達減少巨噬細胞在損傷肺組織中的聚集而抑制炎癥反應(yīng),取得了較好的治療效果,為其臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年SPF雌性Wistar大鼠48只,體質(zhì)量190～200 g,購自湖北省實驗動物研究中心,合格證號:42000600000065,許可證號:SCXK(鄂)2008-0005,實驗前在溫度18～22℃、濕度50%～70%、正常供食供水的清潔動物房常規(guī)飼養(yǎng)7 d,觀察無異常者入組實驗。

1.2 試藥 連花清瘟膠囊干膏粉(以嶺藥業(yè)股份有限公司,規(guī)格:200 g,批號:130232,批準文號:國藥準字Z20040063。處方:連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草,1 g干膏粉相當于藥材5.71 g), Trizol(invitrogen,批號:15596-026),ReverTra Ace q PCR RT-Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO,批號:FSQ-101),THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix實時定量PCR試劑盒(TOYOBO,批號:QPS-201),小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體(Santa Cruz,批號:sc-59103),辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗(Earthox,批號:E030110),大鼠IL-6、TNF-α、MCP-1 ELISA試劑盒(PeproTech,批號分別為900-M86,900-K73,900-M59)。

1.3 PCR引物 大鼠β-actin、白細胞介素6 (interteukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumar necrosis foctor-α,TNF-α)及MCP-1引物經(jīng)PubMed核酸數(shù)據(jù)庫BLAST檢索為基因特異性引物,由上海生工生物工程股份有限公司合成并純化。其各自序列為:β-actin引物,上游:5'-CTTCCTGGG-CATGGAGTCCT-3',下游:5'-GGAGCAATGATCTT-GATCTT-3',產(chǎn)物大小202 bp;IL-6引物,上游:5'-AGCTCATTCTGTCTCGAGCCCACCA-3',下游:5'-AACTGGCTGGAAGTCTCTTGCGGAG-3',產(chǎn)物大小382 bp;TNF-α引物,上游:5'-CACCAAGGGACCAGCCAGGAGGGAG-3',下游:5'-CTCCCTCCTGGCTGGTCCCTTGGTG-3',產(chǎn)物大小145 bp;MCP-1引物,上游:5'-AGGAATGGGTCCAG-AAGTAC-3',下游:5'-AAGTGCTTGAGGTGGTTGTG-3',產(chǎn)物大小177 bp。

1.4 儀器 PRECISE直線加速器(瑞典Elekta公司),S IX51光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司),BIORAD CFX96 PCR儀(美國BIO-RAD公司),VICTOR X2全波長多功能酶標儀(美國PerkinElmer公司)。

1.5 實驗分組 將實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組,對照組、照射組和照射加連花清瘟組,每組16只。照射前3 d至照射后28 d對大鼠灌胃,對照組與照射組給予0.9%氯化鈉溶液2 mL,照射加連花清瘟組給予連花清瘟/0.9%氯化鈉溶液2 mL,給藥量0.42 g·kg-1,每日1次。

1.6 模型的制備 將大鼠用水合氯醛(350 mg·kg-1)麻醉后仰臥位固定在木板上,模擬定位機(Varian Ximatron)透視下確定照射野范圍為右側(cè)全肺,照射野大小約2.8 cm×4.2 cm,在體表勾畫出射野范圍,之后在直線加速器(ELEKEA PRECISE)上擺位,射野外部用多葉光欄遮擋,6 MVX線固定源照射皮距100 cm,劑量率400 cGy·min-1,總劑量單次20 Gy[8]。

1.7 蘇木精-伊紅染色切片 將大鼠右側(cè)肺組織于10%中性甲醛固定液中固定24 h,水洗20 min后梯度酒精脫水,二甲苯透明后石蠟包埋,切片5 μm,烤片后二甲苯脫蠟,脫苯水化后蘇木精染色5 min,分化后伊紅染色15 s,風干后樹膠封片。

1.8 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR) 將大鼠肺組織約20 mg在1 mL Trizol中勻漿,提取總RNA在紫外分光光度儀上測定純度(A260/A280=1.8～2.0)并定量,取mRNA0.5 μg行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),條件為37℃15 min, 98℃5 min;取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL行定量PCR反應(yīng),每個模板重復(fù)4次,條件為95℃預(yù)變性1 min,之后95℃10 s、60℃45 s共40個循環(huán)。將各模板所得的循環(huán)數(shù)閾值(Ct)減去相應(yīng)內(nèi)參β-actin的Ct值得到ΔCt值,采用2-ΔCt法計算各基因相對內(nèi)參的表達量。

1.9 免疫組織化學法 將石蠟包埋的大鼠肺組織切片,烤片過夜后脫蠟,檸檬酸修復(fù)液中高壓1 min,過氧化氫作用10 min后正常山羊血清封閉20 min,洗片后加1∶100稀釋的一抗4℃孵育過夜,洗片后加1∶200稀釋的二抗室溫孵育30 min,洗片后二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)顯色2.5 min,蘇木精復(fù)染2 min,自來水沖洗后脫水、透明、封片。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)實驗 將MCP-1、IL-6和TNF-α捕獲抗體100 μL加入ELISA板中室溫孵育過夜,洗板后封閉1 h,洗板后加入大鼠外周血血清100 μL,每個樣品做復(fù)孔3個,同時分別加入試劑盒提供的標準品以繪制標準曲線,室溫孵育3 h后洗板,加入相應(yīng)酶標二抗室溫孵育30 min后洗板,加入顯色液后酶標儀在波長405 nm(Perkin elmer)讀取吸光度,儀器自動計算出MCP-1、IL-6和TNF-α的濃度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性放射性肺損傷的炎癥反應(yīng) 取實驗4周后大鼠右側(cè)肺組織切片,行蘇木精-伊紅染色。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對照組肺泡組織結(jié)構(gòu)清晰,未見炎癥細胞浸潤;照射組肺組織肺泡間隔水腫明顯,伴大量炎癥細胞浸潤,大鼠表現(xiàn)出呼吸急促等癥狀;照射+連花清瘟組也可見肺組織水腫與炎癥細胞浸潤,伴有呼吸急促癥狀,但程度較照射組明顯減輕,見圖1。提示連花清瘟膠囊具有減輕大鼠急性放射性肺損傷炎癥反應(yīng)的作用。

A.對照組;B.照射組;C.照射+連花清瘟組圖1 3組大鼠肺部炎癥反應(yīng)情況(×100)A.control group;B.radiation group;C.radiation plus lianhuaqingwen groupFig.1 Lung inflammatory response in three groups of rats(×100)

1.對照組;2.照射組;3.照射+連花清瘟組。與對照組比較,*1P＜0.05;與照射組比較,*2P＜0.05圖2 3組大鼠肺組織(A)與血清(B)中IL-6和TNF-α表達情況1.Control group;2.Radiation group;3.Radiation plus lianhuaqingwen group;compared with control group,*1P＜0.05;compared with radiation group,*2P＜0.05Fig.2 Expression of IL-6 and TNF-α in lung(A)and serum(B)in three groups of rats

2.2 急性放射性肺損傷大鼠肺組織與血清IL-6和TNF-α表達 定量RT-PCR檢測實驗4周后大鼠肺組織IL-6和TNF-α mRNA表達,結(jié)果對照組、照射組、照射+連花清瘟組IL-6 mRNA相對于內(nèi)參β-actin水平分別為(0.002 1±0.000 20),(0.006 6±0.000 32), (0.003 9±0.000 22);TNF-α mRNA水平分別為(0.003 7±0.000 16),(0.007 4±0.000 33), (0.005 5±0.000 24)(圖2A)。血清IL-6與TNF-α濃度在對照組、照射組、照射+連花清瘟組中分別(35.2± 10.9),(111.8±26.1),(68.2±15.2)pg·mL-1與(229.3±28.5),(837.5±57.6),(566.9±39.8) pg·mL-1(圖2B)。照射組、照射+連花清瘟組與對照組比較,以及照射+連花清瘟組與照射組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果表明連花清瘟膠囊能夠降低大鼠急性放射性肺損傷肺組織與血清炎癥因子IL-6和TNF-α表達。

2.3 急性放射性肺損傷大鼠肺組織巨噬細胞聚集情況 免疫組織化學法檢測實驗4周后CD68陽性巨噬細胞在大鼠肺組織中的聚集(圖3),棕色細胞為巨噬細胞,Image-Pro PLUS 6.0.0.260軟件對切片進行分析。結(jié)果表明對照組、照射組、照射+連花清瘟組每個高倍鏡視野(×200)下巨噬細胞數(shù)目分別為(59.5± 4.3),(503.9±25.8),(106.2±12.6)。與照射組比較,連花清瘟膠囊可降低巨噬細胞在急性放射性肺損傷大鼠肺組織中的聚集,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 急性放射性肺損傷大鼠肺組織與血清MCP-1表達情況 定量RT-PCR與酶聯(lián)免疫吸附實驗分別檢測實驗4周后大鼠肺組織與血清MCP-1表達。對照組、照射組、照射+連花清瘟組肺組織MCP-1 mRNA相對于內(nèi)參β-actin的水平分別為(0.001 4±0.000 15), (0.005 4±0.000 72),(0.003 2±0.000 17);相應(yīng)血清MCP-1濃度分別為(96.85±8.20),(314.53±12.76), (191.32±10.97)pg·mL-1。連花清瘟膠囊降低了急性放射性肺損傷大鼠肺組織MCP-1 mRNA與血清MCP-1趨化因子水平,照射組、照射+連花清瘟組與對照組比較,以及照射+連花清瘟與照射組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖4。

3 討論

放射誘導(dǎo)的肺損傷目前臨床上治療方法較多,但療效仍需提高[9-10]。連花清瘟膠囊是具有清瘟解毒、宣肺泄熱作用的廣譜抗炎中成藥[11],在急性上呼吸道感染、急性氣管-支氣管炎、社區(qū)獲得性肺炎等感染性炎癥以及肺癌伴發(fā)熱、中風后臟腑閉證高熱等非感染性炎癥的治療中均取得了確切而良好的療效[12]。

巨噬細胞是急性放射性肺炎的始動細胞,在急性與慢性放射性肺損傷的發(fā)生與發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用[13]。黎建緒等[14]也觀察到小鼠在照射72 h后肺組織中有大量巨噬細胞聚集。筆者在預(yù)實驗中觀察到在照射1,2,4,8周大鼠肺組織均有巨噬細胞聚集,但就肺組織中急性炎癥而言,以照射后4周最為典型(結(jié)果未在本文中展示),RYU等[15]的研究同樣觀察到大鼠在照射4周后肺組織中出現(xiàn)明顯的急性炎癥,因此本實驗中選擇照射后4周作為急性放射性肺損傷的研究時間點。筆者在本實驗中發(fā)現(xiàn),連花清瘟膠囊在放射性肺損傷的急性階段通過抑制巨噬細胞的主要趨化因子MCP-1的表達進而抑制巨噬細胞向損傷肺組織中聚集,抑制了急性放射性肺損傷大鼠肺組織與血清中主要炎癥因子IL-6與TNF-α[16]的釋放,從而減輕急性放射性肺損傷的炎癥反應(yīng),緩解了大鼠急性放射性肺損傷的癥狀,在實驗動物體內(nèi)顯示出了較好的療效。

A.對照組;B.照射組;C.照射+連花清瘟組;與對照組比較,*1P＜0.05;與照射組比較,*2P＜0.05圖3 3組大鼠肺組織中巨噬細胞免疫組化染色(A,B,C)與計數(shù)(D)(×200)A.Control group;B.Radiation group;C.Radiation plus lianhuaqingwen group;compared with control group,*1P＜0.05;compared with radiation group,*2P＜0.05Fig.3 Macrophage accumulation were stained by immunohistochemistry(A,B,C)and counted(D)in three groups of rats (×200)

1.對照組;2.照射組;3.照射+連花清瘟組;與對照組比較,*1P＜0.05;與照射組比較,*2P＜0.05圖4 3組大鼠肺組織(A)與血清(B)MCP-1表達情況1.Control group;2.Radiation group;3.Radiation plus lianhuaqingwen group;compared with control group,*1P＜0.05;compared with radiation group,*2P＜0.05Fig.4 MCP-1 expression of lung(A)and serum(B)in three groups of rats

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.002

Lianhuaqingwen Capsules Inhibited the Expression and Effect of MCP-1 in Rats with Radiation-induced Acute Lung Injury

LEI Zhang1,2,LU Hong-da1,2,DONG Ke-chen1,2,LU Chi1,2,CHEN Wei-qun2,YUAN Jing-ping2,3,KONG Qing-zhi1,2
(1.Department of Oncology,the Central Hospital of Wuhan,Wuhan 430014,China;2.Wuhan Cancer Research Institute,Wuhan 430014,China;3.Department of Pathology,the Central Hospital of Wuhan, Wuhan 430014,China)

ObjectiveTo explore the inhibitory effect and possible mechanisms oflianhuaqingwencapsules on radiationinduced acute lung injury in rats.MethodsRats were randomly divided into control group,radiation group and radiation pluslianhuaqingwengroup,the control group and the radiation group rats were given 0.9%sodiumchloride solution,the radiation pluslianhuaqingwengroup rats were givenlianhuaqingwen0.9%chlorine sodiumsolution.HE staining was applied to test the lung tissue inflammation;quantitative RT-PCR and ELISA were used to measure the content of IL-6,TNF-α and MCP-1 in rats; immunohistochemical assay was taken to detect the infiltration of macrophage in lung tissues.ResultsThe relative mRNA expression of IL-6,TNF-α and MCP-1 in the control,radiation model control and radiation plusLianhuaqingwengroups were (0.002 1±0.000 20),(0.006 6±0.000 32),(0.003 9±0.000 22);(0.003 7±0.000 16),(0.007 4±0.000 33),(0.005 5± 0.000 24);(0.001 4±0.000 15),(0.005 4±0.000 72),(0.003 2±0.000 17),respectively;the concentration(pg·mL-1)of IL-6,TNF-α and MCP-1 in the serumwere(35.2±10.9),(111.8±26.1),(68.2±15.2);(229.3±28.5),(837.5±57.6), (566.9±39.8);(96.85±8.20),(314.53±12.76),(191.32±10.97),respectively;and the macrophages at high magnification field in each group were(59.5±4.3),(503.9±25.8)and(106.2±12.6),respectively.Lianhuaqingwencapsules significantly alleviated the lung inflammation in rats with radiation-induced acute lung injury,inhibited the accumulation of macrophage in lung tissue,reduced the expression of IL-6 and TNF-α,and decreased the content of MCP-1 in lung tissues and sera(P＜0.05).ConclusionLianhuaqingwencapsules attenuated the lung inflammation developed in rats with radiation-induced acute lung injury through inhibiting the expression of MCP-1 and reducing the accumulation of macrophage in lung tissues.

Lianhuaqingwencapsule;Injury,lung,acute/radiation;Rat;Monocyte chemotactic protein-1

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0845-05

2014-03-22

2014-04-15

*國家自然科學基金資助項目(81372931, 81101550);湖北省自然科學基金資助項目(2012FFB05904);武漢市科技攻關(guān)計劃項目(2013060602010253)

雷章(1981-),男,湖北公安人,博士,從事惡性腫瘤的診治與研究。E-mail:leizhang003@126.com。

盧宏達(1971-),男,湖北武漢人,主任醫(yī)師,副教授,博士,從事腫瘤分子生物學和腫瘤放療、化療及防護的研究。E-mail:phlonda@163.com。