支興蕾，李存玉，李紅陽，陸揚(yáng)，彭國平

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210029)

右旋糖酐40是經(jīng)發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，均分子量32～42 kDa。臨床常用右旋糖酐40的葡萄糖注射液或氯化鈉注射液。右旋糖酐40常作為血容量擴(kuò)充劑，靜脈注射后能提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外水分而增加血容量，升高和維持血壓［1］。它可使已經(jīng)聚集的紅細(xì)胞和血小板解聚，降低血液黏滯性，改善微循環(huán)，防止血栓形成［2］。此外，還具有滲透性利尿作用［3］，臨床的使用量較大。在其生產(chǎn)工藝中由于其分子量較大，無法采用超濾技術(shù)，因此目前多采用活性炭法去除其原料中的細(xì)菌內(nèi)毒素污染。但是在突發(fā)污染時(shí)，由于活性炭的包合吸附特征［4］，難以保障細(xì)菌內(nèi)毒素的去除效率。如果在放大膜孔徑保證成分透過的同時(shí)也能有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素，則超濾法［5-7］將是一種較理想的技術(shù)，筆者在本實(shí)驗(yàn)中選擇截留分子量為100～300 kDa，不同親水性材質(zhì)的超濾膜(聚醚砜、復(fù)合、聚偏氟乙烯)，進(jìn)行右旋糖酐40的超濾工藝優(yōu)選。參照2010年版《中華人民共和國藥典》二部中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的動(dòng)態(tài)濁度法，定量檢測右旋糖酐40超濾前后細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，同時(shí)用高效液相色譜(HPLC)法檢測超濾前后有效成分右旋糖酐40的變化情況，以去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果和對有效成分的影響優(yōu)選適宜的右旋糖酐40超濾工藝，為右旋糖酐40注射劑的生產(chǎn)工藝中去除細(xì)菌內(nèi)毒素提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Millipore蠕動(dòng)泵，復(fù)合材質(zhì)超濾膜［中空纖維式，膜面積:0.5 m2，聚醚砜與聚偏氟乙烯復(fù)合，截留分子量(MWCO)=100，200，300 kDa;南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào):HVF-1205010，HVF-1205020，HVF-1205030］，聚偏氟乙烯超濾膜(中空纖維式，膜面積:0.5 m2，MWCO=100，200，300 kDa;杭州水清科技環(huán)保有限公司，批號(hào):E2009G4-10，E2009G4-20，E2009G4-30)，聚醚砜超濾膜(中空纖維式，膜面積:0.5 m2，MWCO=100，200，300 kDa;浙江潤達(dá)環(huán)保科技有限公司，批號(hào):PES-1003010，PES-1003020，PES-1003030)。BET-16M細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀、渦旋混合儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)。高效液相色譜儀(日本島津):LC-10ATVP輸液泵，RID-10A示差折光檢測器，CTO-10ASVP柱溫箱;GPC色譜工作站(天津龍智達(dá)公司)。馬爾文激光粒度分析儀(Malvern ZEW3600，Malvern Instruments)。

1.2 試藥 動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào):1003090，λ =0.03 EU·mL－1，規(guī)格:每瓶0.6mL);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):150601-201174，規(guī)格:每瓶160 EU，中國食品藥品檢驗(yàn)研究院);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào):0910190，規(guī)格:每瓶5mL)。右旋糖酐40對照品(中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào):1179876，生化純)。右旋糖酐40原料(北京九州天瑞科技有限公司，一級(jí)，規(guī)格:每袋 100 g，批號(hào):58798-40-2)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 稱取適量右旋糖酐40原料，加超純水溶解，加入一定量的細(xì)菌內(nèi)毒素，煮沸，為原液，得0.1 g·mL－1右旋糖酐40 溶液。

2.2 右旋糖酐40溶液的超濾 取原液2.0 L，分別經(jīng)截留分子量100，200和300 kDa的超濾膜超濾，溶液在超濾之前首先進(jìn)行平衡，排除膜表面、孔徑等因素對溶質(zhì)的吸附影響，平衡時(shí)間以超濾液總流量的4倍藥液體積，進(jìn)而進(jìn)行超濾，待超濾完全后，取樣超濾液。并按式(1)和式(2)分別計(jì)算各藥液中細(xì)菌內(nèi)毒素的去除率以及有效成分的回收率。

Q(%)=(C原－C超)/C原×100%(1)。

式(1)中，Q(%)為內(nèi)毒素的去除率，C超為超濾液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量(EU·mL－1);C原為藥液原液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量(EU·mL－1)。

R'(%)=C'超/C'原×100%(2)。

式(2)中，R(%)為右旋糖酐40的回收率，C'超為超濾液中右旋糖酐40的含量;C'原為藥液原液中右旋糖酐40的含量。

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其可靠性實(shí)驗(yàn) 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶解并稀釋，配制成細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為 2，0.5，0.125，0.031 25 EU·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，各取0.1mL，分別加到預(yù)先加有鱟試劑溶液0.1mL的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，其中每一濃度重復(fù)3管，并同時(shí)作陰性對照3管。以細(xì)菌內(nèi)毒素濃度(C)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間(t)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，按最小二乘法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:LogT=2.986 6－0.315 8 LogC，r=－0.992 7。結(jié)果表明，內(nèi)毒素濃度在 2～0.031 25 EU·mL－1時(shí)，反應(yīng)時(shí)間在840～335 7 s之間，而陰性對照管反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.3.2 干擾實(shí)驗(yàn)及內(nèi)毒素定量測定 按公式最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)=L·C·λ1－1，L為右旋糖酐40的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(0.5 EU·mL－1)，C為1.0mL·mL－1，λ1－1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低細(xì)菌內(nèi)毒素濃度(0.031 25 EU·mL－1)，右旋糖酐40的最大有效稀釋倍數(shù)為16倍。

根據(jù)供試品最大稀釋倍數(shù)，分別將各樣品藥液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋2，4，8，16倍，以此稀釋液作為供試液(negative product control，NPC)，同時(shí)分別將此倍數(shù)稀釋液配制成含內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品0.5 EU·mL－1的溶液，作為陽性對照(positive product control，PPC)。分別取上述溶液0.1mL加到預(yù)先加有0.1mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，其中每一濃度重復(fù)2管。按照下式計(jì)算回收率:回收率(%)=(CPPC－CNPC)/λm×100%。CPPC為樣品陽性對照液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，CNPC為樣品液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，內(nèi)毒素含量單位為EU·mL－1。λm為標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度，即0.5 EU·mL－1。當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率在50% ～200%，則認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。稀釋濃度為2，4，8，16 倍時(shí)，回收率分別為24%，78%，105%，168%，取平均回收率在50% ～200%之間，且更接近于100%的稀釋倍數(shù)時(shí)所測的內(nèi)毒素值作為樣品中內(nèi)毒素的含量，最終選擇稀釋倍數(shù)為8倍，見表1。

2.4 右旋糖酐40的含量測定［8］

2.4.1 色譜條件 色譜柱:TSK-GEL G4000 PWXL柱(7.8mm × 300mm，10 μm);示差折光檢測器，流動(dòng)相:0.71%硫酸鈉溶液;流速:0.5mL·min－1;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.4.2 對照品及供試品溶液的制備 取右旋糖酐40對照品適量精密稱定，加超純水溶解并定容，搖勻，配制成0.1 g·mL－1的右旋糖酐40對照品溶液。取每次超濾前原液和超濾后濾液適量作為供試品溶液待測。

2.4.3 測定法 精密吸取各供試液20 μL注入高效液相色譜儀中分析，計(jì)算各供試品中右旋糖酐40的峰面積。

2.5 右旋糖酐40溶液的粒徑分布檢測 原液和濾液中右旋糖酐40的粒徑分布通過馬爾文激光粒度分析儀檢測。檢測溫度為25℃，分散劑為水，激光光源的波長是633 nm，水的折射率為1.330。

2.6 結(jié)果

2.6.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值 按公式L=K/M為人的最小發(fā)熱閾值5.0 EU·kg－1，M為1 h內(nèi)最大給藥劑量10mL·kg－1。按公式L=K/M計(jì)算得右旋糖酐40的內(nèi)毒素限值為 0.5 EU·mL－1［9］。

2.6.2 細(xì)菌內(nèi)毒素的去除 經(jīng)3種材質(zhì)、3種不同截留分子量超濾膜超濾后，各樣品液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量及細(xì)菌內(nèi)毒素的去除率，見表1。

表1 超濾法去除右旋糖酐40中細(xì)菌內(nèi)毒素的測定結(jié)果Tab.1 Results of removing bacterial endotoxins in dextran 40 injection by ultrafiltration

由表1可知，藥液經(jīng)單一材質(zhì)的PES和PVDF超濾膜超濾后，細(xì)菌內(nèi)毒素的含量仍然很高，PES超濾膜內(nèi)毒素去除率低于20%，PVDF超濾膜地去除率僅約36%。而藥液經(jīng)復(fù)合材質(zhì)的3種孔徑超濾膜超濾后，內(nèi)毒素含量均大幅度降低，低于注射劑中的限值0.5 EU·mL－1，去除率達(dá)到 99%，3種孔徑的膜都能很好地去除右旋糖酐40溶液中的內(nèi)毒素，有效地將熱原污染嚴(yán)重的右旋糖酐40溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素控制在低水平，達(dá)到注射用級(jí)別。

2.6.3 右旋糖酐40的透過率 經(jīng)截留分子量100，200及300 kDa的3種材質(zhì)超濾膜超濾后，右旋糖酐40的透過率見表2。

表2 右旋糖酐40的透過率Tab.2 Transmittance of dextran 40

分析表2數(shù)據(jù)可知，經(jīng)復(fù)合材質(zhì)的分子量300 kDa超濾膜超濾后，右旋糖酐40溶液中的右旋糖酐透過率＞93%，說明該孔徑超濾膜對右旋糖酐基本無影響;但經(jīng)分子量100和200 kDa該材質(zhì)的超濾膜超濾后右旋糖酐損失嚴(yán)重，透過率只有54.77%和77.31%。PES和PVDF超濾膜超濾藥液后，隨著膜孔徑的增大，右旋糖酐40的透過率相應(yīng)增加，孔徑增大到分子量300 kDa時(shí)，右旋糖酐40的透過率均＞91%，說明不同材質(zhì)的大孔徑超濾膜對右旋糖酐40的超濾適用性較好。

2.6.4 超濾前后溶液的平均粒徑分布 右旋糖酐40原液和經(jīng)分子量300 kDa復(fù)合材質(zhì)超濾膜超濾后藥液的粒徑分布圖，見圖1，2。原液和濾液的粒徑均分布約在10 nm，但原液的平均粒徑為10.7 nm，超濾液平均粒徑為7.9 nm。超濾后的右旋糖酐40溶液的平均粒徑降低，分布范圍偏窄，同時(shí)結(jié)合表2中數(shù)據(jù)可知，300 kDa超濾膜處理后右旋糖酐40損失＜10%，說明超濾后的右旋糖酐40中的大分子雜質(zhì)得到了較好的去除。

2.6.5 復(fù)合超濾膜耐受性 稱取適量右旋糖酐40原料，加超純水溶解至10 L，選擇膜面積為0.5 m2，截留分子量為300 kDa的復(fù)合材質(zhì)超濾膜進(jìn)行耐受性實(shí)驗(yàn)，在操作壓力為0.2 MPa下，考察膜通量與藥液循環(huán)體積之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在藥液總循環(huán)藥液量達(dá)到60 L時(shí)，膜通量下降基本穩(wěn)定，說明膜表面已經(jīng)形成了凝膠層，見圖3。

圖1 右旋糖酐40原液粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of detran 40 injection

圖2 分子量300 kDa復(fù)合材質(zhì)膜超濾后濾液粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of detran 40 ultrafiltrated by 300 kDa composite material membrane

圖3 分子量300 kDa復(fù)合超濾膜耐受性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Tolerance test of 300 kDa composite material membrane

3 討論

右旋糖酐40經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)，所以其注射用原料中尚存在一些分子量偏大的聚合物或雜質(zhì)，筆者以超濾技術(shù)中的分子篩分分離原理對右旋糖酐40中大分子物質(zhì)進(jìn)行了較好的去除，且主成分損失不明顯。

在注射劑生產(chǎn)中常采用活性炭去除內(nèi)毒素結(jié)合微濾除菌，此方法很難應(yīng)對內(nèi)毒素的突發(fā)性污染。本實(shí)驗(yàn)用超濾法去除藥液中熱原，并比較復(fù)合材質(zhì)和單一材質(zhì)PES和PVDF兩種膜的超濾效果。對于糖類的大分子物質(zhì)進(jìn)行超濾去內(nèi)毒素，單一材質(zhì)的 PES和PVDF超濾膜效果較差，這可能是由于熱原在單一膜材質(zhì)表面多以單分子或小分子的內(nèi)毒素存在，容易通過大孔徑的超濾膜;而經(jīng)截留分子量300 kDa復(fù)合材質(zhì)的超濾膜聚對右旋糖酐40溶液超濾時(shí)，內(nèi)毒素在膜表面容易以團(tuán)聚的形式存在，并被膜孔截留，從而呈現(xiàn)內(nèi)毒素去除率好的同時(shí)，右旋糖酐40透過率也較高。因此，采用分子量300 kDa特制的復(fù)合材質(zhì)的超濾膜適于右旋糖酐40這類大分子注射劑生產(chǎn)中的內(nèi)毒素的去除，可提升制劑質(zhì)量。

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