李文靜，蔡德富，于慶蓮，牛英才，郭麗娜，洪博

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

紅花系菊科植物紅花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥管狀花，主產(chǎn)于我國新疆、甘肅、河南等地。作為活血化瘀的傳統(tǒng)中藥，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛之功效［1］。學(xué)者們對紅花化學(xué)成分和藥理作用研究較多［2-7］，其中紅花黃色素是紅花活血化瘀功效的有效成分。紅花常被中醫(yī)用于慢性肝病尤其是肝硬化的治療，并有研究報(bào)道，紅花水提物對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化、肝硬化具有抑制作用［8-10］。目 前，已 經(jīng) 明 確 羥 基 紅 花 黃 色 素 A(hydroxysafflor yellow A，HYSA)是紅花黃色素中含量最高的成分［11］，而且是紅花的有效水溶性部位，為了更好地發(fā)揮其藥用功效，需制定合理的提取工藝。本實(shí)驗(yàn)以HYSA含量、浸膏得率和抗肝纖維化藥理作用為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對紅花的抗肝纖維水溶性成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，以期為確定紅花抗肝纖維化的水溶性成分的提取和生產(chǎn)工藝提供更全面的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀(UV2489檢測器，四元高壓梯度泵，柱溫箱;美國Waters公司);LAC214型電子分析天平(常熟市百靈天平儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 試藥 紅花(來源于新疆維吾爾自治區(qū)吉木薩爾縣，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中藥教研室郭麗娜教授鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥管狀花);HYSA對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:111647-200801，規(guī)格:20 mg);色譜純甲醇(北京北醫(yī)大醫(yī)療科技有限責(zé)任公司，批號:27771);磷酸、無水乙醇為分析純(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20120322，20101125);水為純凈水;四氯化碳(CCl4，天津市博迪化工有限公司，批號:20110506);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT，批號:201111)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamate pyruvic aminotransferase，AST，批號:201121)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 選用清潔級SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物使用許可證編號:SCXK(京)2007-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC測定HYSA的含量

2.1.1 色譜柱 Agilent C18柱(4.6mm ×250mm，5 μm);流動相:乙腈-0.2% 磷酸水溶液(30∶70);分析時間為15min;流速:1.0mL·min－1;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:30℃;HYSA含量測定檢測波長為400 nm。

2.1.2 待測溶液的制備 ① 對照品溶液的制備:取HYSA對照品1.0 mg精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1的對照品母液;② 供試品溶液的制備:精密量取正交實(shí)驗(yàn)樣品提取液1～9號藥液，用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.3 專屬性考察 空白實(shí)驗(yàn):吸取溶劑色譜純甲醇，按色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1A;對照實(shí)驗(yàn):吸取對照品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1B;樣品實(shí)驗(yàn):吸取2號供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1C?？瞻讓?shí)驗(yàn)和對照實(shí)驗(yàn)表明，空白無干擾，樣品溶液和對照品溶液在相同保留時間有相應(yīng)色譜峰，其他組分無影響，可以對HYSA進(jìn)行定量分析。

1.羥基紅花黃色素A圖1 空白甲醇(A)、對照品(B)與供試品(C)的HPLC色譜圖1.hydroxysafflor yellow AFig.1 HPLC chromatograms of methanol(A)，reference substance(B)and sample(C)

2.1.4 方法學(xué)考察 ① HYSA線性關(guān)系考察:取0.1 mg·mL－1HYSA對照品溶液稀釋為系列濃度(50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78 μg·mL－1)的對照品溶液，依次進(jìn)樣5 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y=8 479X－3 607.7，r=0.999 8。表 明 HYSA 在 0.78 ～100.00 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好;②儀器精密度實(shí)驗(yàn):取3.12 μg·mL－1HYSA 對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得RSD為1.5%，表明儀器精密度良好;③方法精密度實(shí)驗(yàn):取同一批紅花藥材各約0.5 g，精密稱定，按表2中序號1的操作方法制備供試品溶液，平行操作6份，測定含量，計(jì)算得RSD值1.4%;④ 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一份供試品溶液，分別于 0，2，5，10，12，15 h 各進(jìn)樣 5 μL，測定峰面積。結(jié)果HYSA峰面積RSD為1.1%，表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定;⑤加樣回收率實(shí)驗(yàn):取已知含量的同一批紅花藥材各約0.5 g，精密稱定，共9份，按樣品處理方法制備低、中、高濃度樣品溶液，計(jì)算得每個濃度的平均加樣回收率分別為93.08%，96.91%，99.28%，RSD 分別為 1.2%，0.9%，1.7%。

2.1.5 樣品的制備 取紅花藥材約0.5 g，精密稱定，按表2中方法制備樣品，所得提取液配制成250mL，過濾后采用高效液相色譜分析，并做肝纖維化實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 肝功能指標(biāo)ALT、AST的測定

2.2.1 大鼠分組及模型制備 雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飲食、飲水、活動正常者納入實(shí)驗(yàn)。將50只大鼠編號半隨機(jī)分為10組:第1組(正常對照組)、第2～10組(按照正交表的9個實(shí)驗(yàn)排序)，每組5只。第1組為正常雄性SD大鼠，第2～10組用CCl4復(fù)合制作肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)模型［12］。

2.2.2 給藥處理 造模后第3周起，腹腔注射給予藥物處理，每周5次，第1組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，第2～10組給予不同方法處理的多種紅花水溶液樣品，劑量為 1mL·kg－1(0.5 g·mL－1)。連續(xù)注射8周，于第10周末處死全部大鼠，取材。

2.2.3 ALT、AST測定 第10周末各組大鼠末次給藥后，禁食12 h，3.5%水合氯醛麻醉，摘除眼球取血后處死大鼠。將血液室溫靜置1 h后，4℃離心15min(3 500 r·min－1)，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作檢測ALT、AST含量。

2.3 提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)

2.3.1 正交表設(shè)計(jì) 對影響提取工藝的主要因素溶劑用量(因素A)、提取時間(因素B)，提取次數(shù)(因素C)，提取溶劑(因素D)進(jìn)行L9(34)實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 綜合評分方法 采用排隊(duì)評分法［13］(將全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照指標(biāo)從優(yōu)到劣進(jìn)行排隊(duì))對正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，對于每個指標(biāo)找到最好的結(jié)果，排在第一名，給10分，最后一名，給1分，其他號實(shí)驗(yàn)結(jié)果視其與該指標(biāo)最好的結(jié)果的差異按比例打分，然后對每號實(shí)驗(yàn)的所有分?jǐn)?shù)相加即得綜合評分，綜合評分結(jié)果見表2。

表1 紅花水溶性成分提取工藝因素水平表Tab.1 Factors and levels of extraction process of water solubility component from Carthamus tinctorius L.

2.4 測定結(jié)果分析 綜合評分方差分析結(jié)果見表3。

2.4.1 水平優(yōu)劣分析 表2的A列K值，A1＞A2＞A3，說明A1比A2和 A3好;B 列K值，B1＞B3＞B2，說明 B1比B2和B3好;C 列K值，C2＞C3＞C1，說明 C1比 C2和 C3好，D 列K值，D2＞D1＞D3，說明D2比 D1和D3好。

2.4.2 因素主次分析 由直觀分析表明，因素D的極差R最大，因此是主要影響因素。其次是因素A和C，最后是因素B。

2.4.3 最佳工藝條件分析 由方差分析結(jié)果可得出，因素A和D對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，從具有抗肝纖維化作用和工業(yè)生產(chǎn)提高生產(chǎn)效率的角度出發(fā)，優(yōu)選出的最佳提取工藝條件為A1B1C2D2，即用10倍量10%乙醇，提取2次，每次0.5 h。

2.5 提取工藝驗(yàn)證 為驗(yàn)證該工藝的穩(wěn)定性，按優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。分別取同一批紅花藥材0.5 g，平行3份進(jìn)行提取，得到的HYSA的含量分別為 16.1，15.9，16.4 mg·g－1，RSD 為 1.5%，說明優(yōu)選出的提取工藝合理可行。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，紅花的主要成分是紅花黃色素，紅花黃色素的主要成分為HYSA，是活血化瘀的主要成分。文獻(xiàn)［14］報(bào)道稱紅花與HYSA均具有明顯的降酶保肝作用，而且HYSA作用有優(yōu)于紅花的趨勢。ALT和AST是用于判斷肝纖維化和肝實(shí)質(zhì)受損的主要酶類，所以本研究選擇以HYSA含量和血清中ALT、AST含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選紅花抗肝纖維化水溶性成分的最佳工藝，保證了工藝的有效性和科學(xué)性。

本實(shí)驗(yàn)比較了提取時間對結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)提取1.5 h有效成分含量不比1 h多，部分甚至更低，推測可能是加熱時間過長使有效成分降解所致。

排隊(duì)評分法綜合考慮各指標(biāo)，排序給出評分值，并作為單指標(biāo)分析數(shù)據(jù)，方法簡單，是處理多指標(biāo)問題常用方法，本文綜合評分法結(jié)果與單因素直觀分析和方差分析相結(jié)合確定最佳提取工藝結(jié)果相一致。

表2 紅花水溶性成分提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal experiment on extraction process of water solubility component from Carthamus tinctorius L.

表3 綜合評分方差分析Tab.3 Variance analysis on comprehensive score

中藥材藥效是多成分、多靶點(diǎn)整體作用的結(jié)果，中藥提取工藝優(yōu)選過程中，若采用某單體成分含量為優(yōu)化指標(biāo)，不能反映全方的整體效應(yīng)。筆者嘗試以藥理作用為考察指標(biāo)與有效成分含量相結(jié)合的形式，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評定優(yōu)化紅花水溶性抗肝纖維化成分的提取工藝，較以往可以更有針對性地得到有效成分。

［1］唐旭利，劉靜，李國強(qiáng)，等.紅花藥材水溶性成分 HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥材，2007，30(8):923－926.

［2］任愛農(nóng)，鄒義芳，陸穎，等.紅花多糖的分離純化及單糖組成分析［J］.藥物分析雜志，2013，33(7):1190－1194.

［3］TSUTOMU K，SUSUMU T，HIDETAKA N，et al.A novel and potentbiologicalantioxidant，Kinobeon A，from cellculture of safflower［J］.Life Sci，2003，74(1):87－ 97.

［4］張戈，郭美麗，李穎，等.紅花的化學(xué)成分研究Ⅱ［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(2):220－223.

［5］劉玉明，楊峻明，劉慶華.紅花化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2005，28(4):288－291.

［6］鄭麗娜，韓濤，劉皓，等.紅花促進(jìn)肝星狀細(xì)胞膠原降解的分子機(jī)制［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，15(3):190－192.

［7］袁玉梅，錢曉東，曹恒斌.羥基紅花黃色素A抗腦缺血損傷作用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(8):1046－1050.

［8］趙文麗，姜慶久，吳影.紅花對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的抑制作用［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2004，27(4):4－8.

［9］楊潔，蔡刁龍，譚獻(xiàn)文，等.柴胡、紅花、川芎中藥單體對大鼠肝纖維化治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8(7):1－5.

［10］施韻，盛亮，錢之玉，等.西紅花酸對大鼠酒精性脂肪肝的改善作用及機(jī)制探討［J］.中國新藥雜志，2008，17(24):2115－2119.

［11］姚苗苗，任愛農(nóng)，董仲才.RP-HPLC法同時測定紅花中羥基紅花黃色素A與紅花黃色素A的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30(2):263－266.

［12］游廣輝，張琨.銀杏葉提取物抗大鼠肝纖維化作用及機(jī)制的研究［J］.河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，20(2):109－111.

［13］苑玉鳳.多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)分析［J］.湖北汽車工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，19(4):53－56.

［14］李中原，涂秀華.紅花黃色素的藥理研究進(jìn)展［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16(2):153－156.