李吉鋒，王淑榮

(渭南師范學院化學與生命科學學院藥物分析工程中心，渭南 714099)

柴胡疏肝散分煎混合液和合煎液指紋圖譜及有效成分變化分析*

李吉鋒，王淑榮

(渭南師范學院化學與生命科學學院藥物分析工程中心，渭南 714099)

目的 分析復方柴胡疏肝散分煎液和合煎液中芍藥苷和橙皮苷的溶出量和色譜指紋圖譜相似度,確認是否適合采用臨床顆粒復配方法使用。方法采用高效液相色譜法進行含量測定,用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件對譜圖相似度進行分析。結(jié)果合煎有利于有效成分芍藥苷和橙皮苷的溶出,合煎過程發(fā)生化學反應,有少量新的組分生成或者部分組分消失。結(jié)論復方柴胡疏肝散不適合采用顆粒配方服用。

柴胡疏肝散分煎液；柴胡疏肝散合煎液；溶出量；指紋圖譜

柴胡疏肝散出自《景岳全書》第五十六卷,由陳皮(醋炒)、柴胡各6 g,川芎、枳殼(麩炒)、白芍、香附各4.5 g,甘草(炙)1.5 g組成,可疏肝解郁,主治肝氣郁滯證。傳統(tǒng)中藥煎劑使用方法歷經(jīng)數(shù)千年,各種有效、有害成分的協(xié)同或拮抗效應已經(jīng)過實際檢驗,能夠充分發(fā)揮其藥效,減少毒性。目前一些醫(yī)院為方便患者使用,讓患者將單味顆粒組成復方以后沖服。由于各單味中藥是提前分煎得到,組成復方過程的協(xié)同或者拮抗作用的可能性降低,有可能對于某一方劑的藥效產(chǎn)生影響。對于中藥復方前后單味中藥藥性的變化,科研工作者近年來逐漸從化學角度開始探討。很多分析工作者對于使用比較多的復方進行了分析[1-9]。筆者在本實驗中采用高效液相色譜法對于柴胡疏肝散分煎液和合煎液中的有效成分芍藥苷和橙皮苷的溶出量進行分析比較,討論兩種不同煎煮方法對有效成分溶出的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ShimadzuLC-10ATVP泵,SCL-10AVP控制器,DGU-14A脫氣機,CTO-10AVP柱溫箱,SPD-10AVP紫外檢測器,ShimadzuC-18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),ShimadzuClass-VP6.12工作站,SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮),超聲脫氣機(KQ-250DE數(shù)控超聲,昆山超聲儀器廠)。

1.2 試藥 甲醇(色譜純,天津科密歐),乙腈(色譜純,天津科密歐),磷酸(AR,開封化學試劑廠),二次純化水,芍藥苷對照品(寶雞晨光生物科技有限公司,批號:20121005,純度:98%),橙皮苷對照品(寶雞晨光生物科技有限公司,批號:20120927,純度:98%);柴胡(陜西)、白芍(浙江)、陳皮(江西)、枳殼(江西)、香附(山東)、川芎(四川)、甘草(寧夏)均購自陜西省渭南市老百姓大藥房,所有飲片均經(jīng)駐店藥師確認。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 0.2%磷酸-乙腈梯度洗脫,洗脫程序見表1,流速1.0 mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長230 nm。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版(國家藥典委員會)。

2.2 對照品溶液的制備 配制對照品溶液,稱取芍藥苷和橙皮苷對照品精密稱定,加甲醇超聲溶解后定容于50 mL量瓶,分別配成50.00 mg·L-1對照品溶液。兩種對照品溶液各進樣10 μL的譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 芍藥苷和橙皮苷對照品HPLC色譜圖S1.芍藥苷;S2.橙皮苷

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 合煎液的制備 按照復方用量準確稱取各味中藥于500 mL燒杯,加入8.5倍質(zhì)量二次純化水,蓋上表面皿,浸泡10 min,于電爐上大火燒開,小火煎煮20 min,冷卻后傾出上清液。再加入4.5[9]倍質(zhì)量的二次純化水,大火燒開后小火煎煮15 min,傾出上清液,并與第一次的清液合并,定容到100 mL量瓶。準確量取25.00 mL,水浴低溫蒸干得到顆粒,加入甲醇超聲處理后定容于25 mL量瓶,進樣前用孔徑0.45 μm濾膜過濾[9]。進樣10 μL,合煎液色譜圖見圖2。

2.3.2 分煎混合液的制備 按照復方用量分別準確稱取各味中藥于7個100 mL燒杯,分別加入8.5倍質(zhì)量二次純化水,蓋上表面皿,浸泡10 min,于電爐上大火煮沸,小火煎煮20 min,冷卻后分別傾出上清液,混合于同一燒杯中。分別在7種中藥中各加入4.5倍質(zhì)量二次純化水,大火煮沸后小火煎煮15 min,冷卻后分別傾出上清液,混合后與第一次的合并,定容到100 mL量瓶。準確量取25.00 mL,水浴低溫蒸干得到顆粒,加入甲醇超聲處理后定容于25 mL量瓶。進樣前用孔徑0.45 μm濾膜過濾。進樣10 μL,分煎液譜圖見圖2。對合煎液和分煎液指紋圖譜采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版進行相似度分析比較。

2.4 色譜測定方法考察

2.4.1 精密度實驗 將2種對照品溶液各連續(xù)進樣5次,測定色譜峰面積。芍藥苷和橙皮苷面積的RSD分別為1.6%和1.3%,表明方法精密度較好。

圖2 柴胡疏肝散合煎液和分煎液HPLC圖S1.分煎液;S2.合煎液

2.4.2 線性范圍考察 分別取各對照品溶液分別進樣5,10,15,20,25 μL,分別測定峰面積。以測得的各對照品溶液的峰面積為縱坐標,以進樣量為橫坐標,得到標準回歸方程和相關(guān)性系數(shù)。各對照品在0.25～1.25 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。芍藥苷回歸方程Y= 58 704X+519 939,r=0.993 2;橙皮苷回歸方程Y=174 674X+457 984,r=0.997 3。

2.4.3 回收率實驗 準確量取混合后合煎液25.00 mL,加入一定量芍藥苷和橙皮苷標準溶液,水浴低溫蒸干,加入甲醇超聲處理后定容于25 mL量瓶。進樣前用孔徑0.45 μm濾膜過濾,測定后計算各個對照品的回收率。

據(jù)“2.3.3”加標實驗測定結(jié)果計算,加標回收率分別為芍藥苷92.5%和橙皮苷95.4%(5次平均,RSD分別為1.2%和1.4%),方法準確性較好。見表2。

表2 芍藥苷和橙皮苷回收率實驗結(jié)果 mg

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取分煎液,分別在0,2,4,8,12 h進樣,測定峰面積,結(jié)果芍藥苷和橙皮苷的RSD分別為0.9%,1.3%。

2.4.5 重復性實驗 按照“2.3.1”項制備合煎液溶液5份,分別測定芍藥苷和橙皮苷的含量,RSD分別為1.2%和1.2%。

2.5 測定結(jié)果 將“2.3.1”和“2.3.2”項實驗所得溶液分別用HPLC在“1.1”項儀器工作條件下測定。結(jié)果復方后合煎液芍藥苷含量1.456 mg,橙皮苷含量0.578 mg,分煎后混合液芍藥苷與橙皮苷含量分別為1.332和0.324 mg。

3 討論

中藥組成復方后可能存在協(xié)同或者拮抗效應,使得煎煮過程中各種有效成分的溶出率發(fā)生變化,也可能發(fā)生化學反應,使得某一組分的溶出量發(fā)生變化,從而對其功效產(chǎn)生影響。中成藥加工過程充分考慮以上因素,采取方劑合煎后,將得到的粉末制成丸劑或者片劑服用,使得其組成和煎劑相同,功效相同。而目前一些醫(yī)院采用將分煎后得到的顆粒按照復方混合沖服的方法沒有充分考慮以上問題。針對可能存在的問題,筆者選擇傳統(tǒng)的柴胡疏肝散方劑,針對其中芍藥苷和橙皮苷的溶出量進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對于柴胡疏肝散而言,合煎液中芍藥苷溶出量(1.456 mg)稍高于分煎液(1.332 mg),合煎液橙皮苷溶出量明顯高于分煎液,接近或達到分煎液溶出量的兩倍。實驗結(jié)果說明,對于柴胡疏肝散而言,合煎可能由于協(xié)同效應等,更有利于其有效成分芍藥苷和橙皮苷的溶出,使得藥效更明顯。采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件分析后發(fā)現(xiàn),分煎液和合煎液的譜圖相似度為0.953,這表明在合煎過程中發(fā)生了化學反應,有少量新的組分生成或者部分組分消失,如在約15 min和48 min合煎液相對分煎液分別減少一個吸收峰,具體組分確認及變化分析需要結(jié)合質(zhì)譜測定結(jié)果進行分析。除芍藥苷和橙皮苷外,從圖2還可以發(fā)現(xiàn),兩個譜圖中的其他一些峰高度也存在差異,說明合煎使得不同組分的溶出率發(fā)生了變化。綜上所述,建議柴胡疏肝散臨床使用不采用顆粒物配伍使用的方法,而盡可能采用生藥合煎服用的方法。

[1] 李丹,閻姝.茵陳蒿湯及其單味顆粒中7種成分比較[J].醫(yī)藥導報,2013,32(2):215-218.

[2] 楊翀,梁光義,曹佩雪,等.三拗湯不同配伍中麻黃堿、甘草酸和苦杏仁苷的變化[J].中草藥,2008,39(3):372-375.

[3] 何麗仙,黃忠京,譚倪,等.中藥復脈湯復方與單方提取物化學成分的分析研究[J].中山大學學報,2006,45(3): 120-122.

[4] 容蓉,袁久榮,王學智.HPLC測定四物湯及其方劑中阿魏酸的煎出量[J].中國藥學雜志,2000,35(11):767-768.

[5] 張獻沖,雷鵬,李新中.酸棗仁湯傳統(tǒng)煎劑與配方顆粒煎劑中芒果苷、阿魏酸、甘草苷含量測定比較[J].中藥材, 2008,31(3):452-454.

[6] 辛楊,皮子鳳,宋鳳瑞,等.超高效液相色譜-質(zhì)譜法比較黑順片單煎液及其復方煎煮液中次烏頭堿在大鼠體內(nèi)的吸收[J].色譜,2011,29(5):389-393.

[7] 胡強,馮華,周勇,等.HPLC法測定厚樸溫中湯不同煎液中和厚樸酚的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2011,25 (6):80-82.

[8] 唐倩,石珊,趙云麗,等.HPLC法測定厚樸溫中湯中山姜素、和厚樸酚、小豆蔻明和厚樸酚[J].中草藥,2009,40 (10):1581-1583.

[9] 邵進明,徐必學,曹佩雪,等.高效液相色譜法測定清胃散不同煎液中阿魏酸等成分的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2008,28(11):868-870.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.035

R286;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0392-03

2013-05-01

2013-06-22

*陜西省軍民融合研究基金(12JMR12)

李吉鋒(1977-),男,山東青島人,副教授,碩士,主要從事藥物分析工作。電話:0913-2136931,E-mail：ustc1@163.com。