李蘭茹，馬慧萍，何蕾，董志臣，賈正平

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，蘭州 730050)

蟲草保元膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量測定

李蘭茹，馬慧萍，何蕾，董志臣，賈正平

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，蘭州 730050)

目的 采用高效液相色譜法測定蟲草保元膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量。方法色譜柱為Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇∶水(48∶52),檢測波長:440 nm;柱溫室溫,流速: 1.0 mL·min-1。結(jié)果西紅花苷-Ⅰ在6～45 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=1.000 0,平均回收率98.73%,RSD為1.24%(n=6);西紅花苷-Ⅱ在3.2～24.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=1.000 0,平均回收率98.01%,RSD為1.53%(n=6)。結(jié)論該方法操作簡便,測定結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于蟲草保元膠囊的質(zhì)量控制。

蟲草保元膠囊；西紅花苷-Ⅰ；西紅花苷-Ⅱ；色譜法,高效液相；含量測定

蟲草保元膠囊是我院自制中藥復(fù)方制劑,由蟲草、西紅花、黃芪、麥冬等多味藥材組成,具有益氣養(yǎng)血、補益肺脾、補腎固精、養(yǎng)陰生津之功效。主要用于初入高原地區(qū)而致頭暈頭昏、心慌心悸、胸悶氣短、腰酸腿困、疲乏無力、精神欠佳等,亦可作為保健應(yīng)用。該方有抗疲勞、抗缺氧、抗衰老作用,能明顯改善缺氧和疲勞不適,改善機體供氧狀態(tài),提高工作效率,增強學(xué)習(xí)記憶能力。西紅花為方中君藥,其主要有效成分為西紅花酸和西紅花苷,均具有多種藥理作用,其中西紅花苷主要由西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ和西紅花苷-Ⅳ組成[1-3]。這些西紅花苷是用于評價西紅花質(zhì)量優(yōu)劣的指標(biāo)性成分,2010年版《中華人民共和國藥典》通過測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量來控制西紅花的質(zhì)量[4]。為更好地控制其內(nèi)在質(zhì)量,筆者選擇處方中西紅花作為研究對象,采用高效液相色譜法對其中的西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ進行含量測定[5-6],為該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 600-996型高效液相色譜儀,包括Waters 996光電二極管陣列檢測器,Waters 600泵, Waters 600控制器;SK3300LH型超聲清洗機(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);AE200電子天平(上海梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥 西紅花苷-Ⅰ對照品(批號:111588-200501)、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?批號:111589-201103)由中國食品藥品檢定研究院提供,蟲草保元膠囊(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院生產(chǎn),批號:20110401,20110402, 20110403),甲醇為色譜純,其余為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(48∶52);流速:1 mL·min-1;柱溫:室溫;檢測波長:440 nm,進樣量:20 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌愤m量,加稀乙醇分別制成每毫升含西紅花苷-Ⅰ300 μg、西紅花苷-Ⅱ160 μg的溶液,作為貯備液。臨用時分別精密量取上述兩種對照品溶液貯備液各1 mL,置10 mL量瓶,混勻,加稀乙醇稀釋至刻度,即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品10粒,傾出內(nèi)容物研細(xì)混勻,取約0.1 g,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加稀乙醇適量溶解,置冰浴中超聲處理30 min,放置室溫,加稀乙醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過,即得[4]。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取除西紅花外的其他處方量藥材,按工藝制備方法制備成缺西紅花的陰性樣品,按上述供試品溶液制備方法制成缺西紅花的陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性實驗 分別取對照品溶液,供試品溶液及陰性對照溶液各20 μL進樣測定。在選定色譜條件下,西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ色譜峰可達基線分離,分離度(R)＞1.5,理論板數(shù)按西紅花苷-Ⅰ峰計算不低于3 500。樣品色譜圖與對照品色譜圖一致,陰性樣品在西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ色譜峰位置處無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn),結(jié)果見圖1。

圖1 蟲草保元膠囊高效液相色譜圖A.陰性樣品;B.對照品;C.供試品;1.西紅花苷-Ⅰ;2.西紅花苷-ⅡFig.1 HPLC chromatograms of chongcaobaoyuan CapsulesA.negative sample;B.regerence;C.sample solution;1.Crocin-Ⅰ;2.Crocin-Ⅱ

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液(含西紅花苷-Ⅰ300 μg·mL-1和西紅花苷-Ⅱ160 μg·mL-1) 0.2,0.4,0.8,1.0,1.2,1.5 mL分置10 mL量瓶,加稀乙醇稀釋到刻度,搖勻,按上述條件測定。以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的濃度為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),經(jīng)線性回歸。其回歸方程為A西紅花苷-Ⅰ= 93 593C-4 681.7,r=1.000 0(n=6),結(jié)果表明西紅花苷-Ⅰ在6～45 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。A西紅花苷-Ⅱ=115 181C-4 665.1,r=1.000 0(n=6),結(jié)果表明西紅花苷-Ⅱ在3.2～24.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度實驗 精密吸取“2.2”項混合對照品溶液20 μL,連續(xù)進樣5次,結(jié)果西紅花苷-Ⅰ峰面積積分值RSD=0.68%,西紅花苷-Ⅱ峰面積積分值的RSD= 0.96%(n=5),說明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液(批號: 20110401),室溫放置,20 h內(nèi)每隔2 h進樣20 μL,測定峰面積,西紅花苷-Ⅰ峰面積積分值RSD=1.57% (n=6),西紅花苷-Ⅱ峰面積積分值RSD=1.28%,表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性實驗 取同一批號(批號:20110401)樣品,按“2.3”項方法制備6份供試品溶液,照高效液相色譜法,按外標(biāo)法計算西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總量,平均含量11.35 mg·g-1,RSD=1.86%(n=6)。

2.10 加樣回收率實驗 稱取已知含量的樣品(含西紅花苷-Ⅰ8.54 mg·g-1和西紅花苷-Ⅱ2.82 mg·g-1) 6份,每份約0.05 g,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,精密加入西紅花苷-Ⅰ對照品(濃度為0.456 mg·mL-1)和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?濃度為0.152 mg·mL-1)各1.0 mL,按樣品制備方法制得加樣回收實驗的供試品溶液,進樣20 μL,依法測定,計算回收率。結(jié)果見表1。西紅花苷-Ⅰ平均回收率98.73%,RSD=1.24%;西紅花苷-Ⅱ平均回收率98.01%,RSD=1.53%。見表1。

2.11 樣品含量測定 按上述色譜條件和方法測定3批樣品中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量,結(jié)果見表2。

3 討論

西紅花又稱藏紅花、番紅花,是鳶尾科番紅花(Crocus sativusL.)的干燥柱頭,屬名貴藥材。其主要活性成分是西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ等苷類成分,但二者性質(zhì)很不穩(wěn)定,見光易降解,影響了含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確度,因此實驗中供試品溶液的制備采用棕色量瓶[7]。

表1 西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ加樣回收率測定結(jié)果(n=6)Tab.1 Result of recovery test of Crocin-Ⅰand Crocin-Ⅱ mg

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Content determination of samples mg

筆者在本實驗對西紅花樣品和西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤哼M行紫外掃描,找出西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ最大吸收波長,經(jīng)綜合考慮選擇440nm作為檢測波長。

實驗首先按照《中華人民共和國藥典》2010年版一部“西紅花”含量測定所采用的甲醇-水(45∶55)為流動相[4],Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)為色譜柱進行實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的出峰時間較晚。后通過反復(fù)實驗調(diào)整,以Hypersil ODS2 C18柱為色譜柱,甲醇-水(48∶52)作為流動相,組合成的色譜條件對樣品的分離較好,保留時間明顯縮短(6～14 min),且能達到良好的基線分離,陰性無干擾,故確定選用此色譜系統(tǒng)。

蟲草保元膠囊為我院自制制劑,其化學(xué)成分復(fù)雜多樣,本實驗采用高效液相色譜法同時測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ,結(jié)果表明該法操作簡便,準(zhǔn)確性好,靈敏度高,重復(fù)性好,結(jié)果穩(wěn)定,可用于該制劑的質(zhì)量控制。

[1] 李偉平,張云,丁志山.西紅花的研究進展[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,25(3):55-58.

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[3] 譚安雄,朱耀斌,王玉銀.西紅花酸對大鼠腦缺血-再灌注氧自由基及一氧化氮的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,30 (7):846-848.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:120-121.

[5] 袁瑞瑛,歐珠羅布,江春艷,等.二十五味珊瑚丸中西紅花苷Ⅰ&Ⅱ的含量測定研究[J].西藏大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2012,27(11):36-39.

[6] 尼珍,阿萍,格桑索朗.HPLC法測定藏藥二十五味珍珠丸中西紅花苷Ⅰ的含量[J].藥物分析雜志,2011,31 (1):151-153

[7] 何常明,謝曉梅,何美蓮,等.西紅花中西紅花苷-1和西紅花苷-2含量測定方法的建立[J].藥物分析雜志,2006,26 (9):1270-1273.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.028

Content Determination of Crocin-Ⅰand Crocin-Ⅱin Chongcao Baoyuan Capsules

LI Lan-ru,MA Hui-ping,HE Lei,DONG Zhi-cheng,JIA Zheng-ping
(Department of Pharmacy,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Military Command;Key Laboratory of the Prevention and Cure for the Plateau Environment Damage,PLA,Lanzhou 730050,China)

Objective To establish a HPLC method for the content determination of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱinchongcao baoyuancapsules.MethodsThe HPLC method was carried out on a Hypersil ODS2 C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm),with methanol-water(48∶52)as the mobile phase,using the detection wavelength of 440 nm and the flow rate of 1.0 mL·min-1.ResultsThe calibration curves of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱwere linear in the ranges of 6-45 μg·mL-1(r= 1.000 0)and 3.2-24 μg·mL-1(r=1.000 0),respectively.The average recoveries were 98.73%(RSD=1.24%,n=6)for crocin-Ⅰand 98.01%(RSD=1.53%,n=6)for crocin-Ⅱ.ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible, which is suitible for the quality control ofchongcao baoyuancapsules.

Chongcao baoyuancapsules;Crocin-Ⅰ;Crocin-Ⅱ;HPLC;Content determination

R286;R978.1

A

1004-0781(2014)03-0370-03

2013-06-05

2013-07-22

李蘭茹(1969-),女,河北泊頭人,主管藥師,學(xué)士,主要從事藥品檢驗工作。電話:0931-8994671,E-mail：13919271845@163.com。

賈正平(1957-),男,山西太原人,教授,博士生導(dǎo)師,主任藥師,主要從事醫(yī)院藥學(xué)、臨床藥理和新藥研究工作。電話:0931-8994652,E-mail：jzp2013@aliyun.com.cn。