馬杰，楊偉，關碩，胡俊霞，高文斌，曾常茜，梁文波

(1.遵義醫(yī)學院，遵義 563000;2.大連大學醫(yī)學院，大連 116622;3.大連大學附屬中山醫(yī)院腫瘤科，大連116000)

西黃丸乙酸乙酯提取物抗腫瘤活性研究*

馬杰1，楊偉2，關碩2，胡俊霞2，高文斌3，曾常茜2，梁文波2

(1.遵義醫(yī)學院，遵義 563000;2.大連大學醫(yī)學院，大連 116622;3.大連大學附屬中山醫(yī)院腫瘤科，大連116000)

目的 研究西黃丸乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用及對荷瘤大鼠免疫功能的影響,篩查西黃丸的抗腫瘤活性部位。方法用W256乳腺癌細胞建立荷瘤大鼠模型,隨機分為正常對照組,模型對照組,陽性藥物(香菇多糖)組,西黃丸高劑量組,西黃丸乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組。給藥治療14 d,取瘤稱重,計算抑瘤率;腹主動脈取血,流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群及B7-1的含量;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測外周血白細胞介素2(IL-2)、IL-6、IL-10、β轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、γ干擾素(IFN-γ)表達水平。結果西黃丸乙酸乙酯高劑量組抑瘤率30.41%;西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組、B7-1含量及IL-2、IFN-γ水平均高于模型對照組,IL-6及TGF-β水平均低于模型組;IL-10與陰性對照組比較,均差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論西黃丸乙酸乙酯提取物通過上調(diào)IL-2、IFN-γ水平及提高細胞含量,降低腫瘤相關炎性因子IL-6、TGF-β水平,提高了機體免疫清除功能,發(fā)揮抗腫瘤作用,提高原藥生物利用度。乙酸乙酯提取物可能是西黃丸的主要活性部位之一。

西黃丸；乙酸乙酯提取物；乳腺癌；腫瘤；細胞因子

西黃丸又稱犀黃丸,出自清代王洪緒所著《外科證治全生集·卷四》,由牛黃、麝香、乳香(醋制)、沒藥(醋制)4味名貴中藥組成,是抗腫瘤中成藥的經(jīng)典名方,其主要功效為清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結等[1]。目前廣泛用于乳腺癌、肝癌、白血病等惡性腫瘤的治療及輔助治療,臨床證實其可提高腫瘤患者的生存率,改善中晚期腫瘤患者的生活質(zhì)量[2]。現(xiàn)代藥理研究證實,西黃丸組方藥材富含抗癌成分,且主要為脂溶性成分,如?；撬帷⒛懠t素、麝香酮、β-欖香烯等[3]。筆者通過對西黃丸進行水蒸汽、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇梯度提取,證實三氯甲烷、乙醇提取的組分均具有良好的抗腫瘤作用[4]。筆者在本實驗中觀察西黃丸乙酸乙酯提取物對荷瘤大鼠腫瘤生長的抑制作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 清潔級Wistar大鼠,雌性,體質(zhì)量(180±20)g(70只)及(70±10)g(10只),購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(遼)20080002。大鼠乳腺癌細胞株Walker256,購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 儀器 流式檢測儀FACSVantage為BD公司產(chǎn)品;ELX800型酶標儀為美國BioTek公司產(chǎn)品;PL203型電子精密天平為梅特勒托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;飛鴿TDL-40B型臺式離心機為上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試劑 熒光標記抗體Anti-Rat CD3 PE;Anti-Rat CD4 FITC;Anti-Rat CD8a PerCP購自于美國Bioscience公司;Anti-Rat CD80 PE購自于美國BioLegend公司;大鼠ELISA試劑盒白細胞介素2(interleukin 2,IL-2)、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming grouth factor, TGF-β)、干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)由上海朗頓生物科技有限公司生產(chǎn);淋巴細胞分離液為TBD science公司產(chǎn)品;肝素鈉注射液(批號:100103)為上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。西黃丸(每20粒質(zhì)量1 g)由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)(批號:11020073);香菇多糖由浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產(chǎn)(基片質(zhì)量0.1 g,批號:120501)。

1.4 西黃丸乙酸乙酯提取物的制備 ①取西黃丸180 g,粉碎,轉(zhuǎn)入500 mL圓底燒瓶,加入3倍體積無水乙酸乙酯,超聲振蕩30 min,組裝熱回流提取裝置,于電熱套上加熱回流提取2 h,濾紙過濾,收集濾液;濾渣重復提取2次。合并3次提取液,于37℃恒溫水浴鍋中揮發(fā)乙酸乙酯,得乙酸乙酯提取物收率為7.9%。②采用人與大鼠劑量換算公式,計算各組給藥量,西黃丸乙酸乙酯提取物高、中、低分別按108.6,43.5, 21.7 mg·kg-1,西黃丸高劑量按1.37 g·kg-1,陽性對照(香菇多糖)按230 mg·kg-1,以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液為溶劑,將給藥劑量配制為1 mL·(100 g)-1。空白對照組及模型對照組給予等量溶劑。

1.5 動物模型的建立 ①調(diào)整Walker256細胞濃度為2×107個·mL-1,抽取細胞1 mL,注入(70±10)g雌性Wistar鼠腹腔,傳代。7～8 d小鼠出現(xiàn)明顯腹水癥狀,收集腹水,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌,調(diào)整細胞濃度為5×107·mL-1。將(180±20)gWistar雌性大鼠,隨機取10只不做處理為正常對照;其他按每只0.4 mL腫瘤細胞接種于大鼠右側(cè)腋下建立荷瘤模型,隨機分為6組,每組10只[5]。②造模后第2天起,按體質(zhì)量灌胃給藥,每天2次,連續(xù)給藥14 d。

1.6 大鼠抑瘤率的測定 末次給藥前禁食12 h,以20%烏拉坦腹腔麻醉。鈍性剝離瘤組織,取瘤稱質(zhì)量,計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(模型對照組平均瘤質(zhì)量-治療后平均瘤質(zhì)量)/模型對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.7 流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群及B7-1的含量腹主動脈取血2 mL,適量肝素抗凝,加入等體積PBS液,混勻;緩慢轉(zhuǎn)入2 mL淋巴細胞分離液上層,室溫2 000 r·min-1離心20 min;收集淋巴細胞,避光條件下加入相應抗體染色。4℃避光,冰浴20 min,用流式細胞儀檢測及黏附分子B7-1含量。

1.8 酶聯(lián)免疫法檢測IL-2、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ的表達水平 新鮮血液置于37℃恒溫水浴鍋靜置4 h,3 500 r·min-1室溫離心10 min,吸取上層血清,嚴格按照大鼠IL-2、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ定量酶聯(lián)檢測試劑盒說明書操作。在酶標儀波長450 nm處測吸光度(A)值,通過標準曲線獲取血清中IL-6、IL-10、TGF-β濃度。

2 結果

2.1 西黃丸乙酸乙酯提取物對荷瘤大鼠腫瘤生長的影響 接種Walker256后,大鼠精神狀態(tài)較差,進食減少,行動呆滯,皮毛粗糙無光澤;4～5 d均有瘤塊實體直徑約0.5 cm。而陽性對照及西黃丸乙酸乙酯提取物給藥組大鼠食量及運動狀態(tài)均好于模型對照組。西黃丸乙酸乙酯提取物具有一定的抑瘤作用,其高劑量組抑瘤率30.41%,與模型對照組比較,瘤質(zhì)量顯著降低(P＜0.05);與西黃丸高劑量組(33.13%)比較,差異無統(tǒng)計學意義,結果見表1。

2.2 西黃丸乙酸乙酯提取物對荷瘤大鼠外周血淋巴細胞亞群及B7-1含量的影響 與正常對照組比較,模型對照組血清含量顯著降低(P＜ 0.05);西黃丸乙酸乙酯提取物中劑量組綜合指標優(yōu)于西黃丸高劑量組,差異無統(tǒng)計學意義;與模型對照組比較,西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組1含量顯著升高(P＜0.01),結果見表2。

2.3 西黃丸乙酸乙酯提取物對荷瘤大鼠外周血細胞因子的影響 與正常對照組比較,模型對照組血清IL-2、IFN-γ水平顯著降低,IL-6、IL-10、TGF-β水平顯著升高(P＜0.01);與模型對照組比較,西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組血清IL-2、IFN-γ水平顯著升高(P＜0.01),IL-6、TGF-β顯著降低(P＜0.05),結果見表3,4。

表1 7組大鼠腫瘤生長的情況Tab.1 The tumor growth of seven groups of rats ±s

表1 7組大鼠腫瘤生長的情況Tab.1 The tumor growth of seven groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.05

組別劑量/(mg·kg-1)大鼠/只瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%正常對照組0.0100.00±0.000.00模型對照組0.0106.61±0.610.00西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組108.6104.60±0.42*130.41中劑量組43.5105.13±0.3722.39低劑量組21.7105.71±0.5013.62西黃丸高劑量組1 370104.42±0.57*133.13香菇多糖組230105.00±0.44*124.36

3 討論

西黃丸由牛黃、麝香、乳香、沒藥粉碎,輔以黏米飯制成,其活性組分在治療中主要依賴溶出,生物利用度不高。筆者采用水蒸汽、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇進行梯度提取,以篩選西黃丸抗腫瘤的活性部位,提高其生物利用度。研究結果顯示,西黃丸乙酸乙酯提取物具有明確的抑瘤作用,與模型對照組比較,高劑量組瘤質(zhì)量明顯降低,但其抗腫瘤活性與西黃丸高劑量組類似,提示西黃丸乙酸乙酯提取物是西黃丸抗腫瘤作用主要活性部位之一。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅取決于腫瘤細胞本身,還取決于腫瘤細胞生存的環(huán)境[6]。免疫系統(tǒng)具有免疫清除功能,因而消滅和殺傷腫瘤細胞;但同時也會對腫瘤細胞產(chǎn)生“篩選”作用,這可能促進腫瘤向惡性程度的分化,而腫瘤細胞也會對機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重塑作用,改變機體的免疫環(huán)境。隨著對腫瘤免疫機制的深入研究,免疫編輯理論的提出深刻地闡釋了機體免疫系統(tǒng)與腫瘤的相互作用,即免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸[7]。在免疫清除過程中,IL-2、IFN-γ可促進CD+3、CD+4的含量,提高腫瘤細胞的抗原提呈能力,促進機體對腫瘤細胞的識別能力;同時誘導CD+8的產(chǎn)生對腫瘤細胞產(chǎn)生靶向殺傷作用[8]。黏附分子B7是T細胞活化、增殖的重要共刺激信號,可促進T細胞的活化增殖。本研究發(fā)現(xiàn),西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量可顯著提高IL-2、IFN-γ的水平及CD+3、CD+8、B7-1的含量,說明西黃丸乙酸乙酯提取物可提高荷瘤機體的免疫清除功能。

研究表明,IL-6、IL-10、TGF-β是形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境的重要因子,具有抑制免疫和促進腫瘤生長的作用。腫瘤組織通過高分泌IL-6,誘導機體免疫耐受促進腫瘤生長,且多種惡性腫瘤與IL-6表達呈正相關[9]。IL-10可以通過抑制抗原提呈細胞的提呈作用[10]。TGF-β可以抑制機體的多重抗腫瘤效應,抑制淋巴細胞產(chǎn)生IL-2,促進血管生成等[11]。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量西黃丸乙酸乙酯提取物可顯著降低IL-6、TGF-β的水平,發(fā)揮提高腫瘤細胞免疫原性,激活淋巴細胞產(chǎn)生抗腫瘤作用,進一步增強免疫清除功能,提示西黃丸乙酸乙酯提取物可能具有逆轉(zhuǎn)免疫逃逸的作用。有關西黃丸抗腫瘤物質(zhì)基礎及其逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài)的分子作用機制尚需進一步研究。

表2 7組大鼠外周血淋巴細胞亞群及B7-1的檢測值Tab.2 The detection results of peripheral blood lymphocyte subset and B7-1 in seven groups of rats ±s,%,n=10

表2 7組大鼠外周血淋巴細胞亞群及B7-1的檢測值Tab.2 The detection results of peripheral blood lymphocyte subset and B7-1 in seven groups of rats ±s,%,n=10

與模型對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1)CD+3CD+4CD+8B7-1(CD80)正常對照組100.080.95±5.25*149.94±4.29*131.02±4.06*142.07±6.96*1模型對照組100.041.25±2.9119.09±3.1422.13±2.0814.49±5.19西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組10108.657.37±3.25*227.99±2.5629.38±2.73*228.26±3.05*2中劑量組1043.555.06±3.7424.14±4.0030.92±4.03*124.39±3.29*2低劑量組1021.746.61±4.3621.94±3.8724.67±3.6416.63±4.24西黃丸高劑量組101 37058.98±5.56*231.99±3.1026.99±5.7025.83±2.12*2香菇多糖組1023058.84±4.51*230.69±2.0328.15±3.73*221.93±5.07*2

表3 7組大鼠外周血IL-2、IL-6、IL-10的檢測值Tab.3 The detection results of IL-2,IL-6 and IL-10 in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s

表3 7組大鼠外周血IL-2、IL-6、IL-10的檢測值Tab.3 The detection results of IL-2,IL-6 and IL-10 in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1)IL-2IL-6IL-10正常對照組100.0218.33±15.87*141.79±7.39*148.68±3.43*1模型對照組100.0147.86±12.07103.96±8.5793.19±2.45西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組10108.6195.45±11.24*260.42±6.18*285.34±3.76中劑量組1043.5183.39±10.93*283.30±7.8384.73±4.48低劑量組1021.7162.02±12.7685.69±9.0287.46±3.59西黃丸高劑量組101 370190.62±10.90*272.60±7.63*270.30±5.08*2香菇多糖組10230187.80±8.09*277.81±7.21*285.24±2.04

表4 7組大鼠外周血TGF-β、IFN-γ的檢測值Tab.4 The detection results of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s,n=10

表4 7組大鼠外周血TGF-β、IFN-γ的檢測值Tab.4 The detection results of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s,n=10

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別劑量/(mg·kg-1)TGF-βIFN-γ正常對照組0.0139.02±12.61*1267.42±11.65*1模型對照組0.0221.22±13.75195.08±6.95西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組108.6162.35±10.17*2251.28±7.33*1中劑量組43.5185.46±8.89225.55±9.58低劑量組21.7206.08±9.26203.83±6.79西黃丸高劑量組1 370170.48±6.51*2246.80±10.38*2香菇多糖組230183.57±7.46243.38±8.61*2

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.008

Antitumor Effects of Ethyl Acetate Extract from Xihuang Pills

MA Jie1,YANG Wei2,GUAN Shuo2,HU Jun-xia2,GAO Wen-bin3,ZENG Chang-qian2,LIANG Wen-bo2
(1.Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China;2.Medical College of Dalian University,Dalian 116622, China;3.Department of Oncology,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian,116000,China)

Objective This research aimed to study the antitumor activity and immunologic function of ethyl acetate extracts fromχihuangpills on tumor-bearing rats.MethodsThe Walker256 bearing rats were randomly divided into 7 groups (n=10):normal control,model control,different doses of ethyl acetate extracts fromχihuangpills,and lentinan plus high dose ofχihuangpill groups.After the drug administration for a consecutive 14 days,the inhibitory rate of tumor was measured.FCM method was used in determination of serum levels ofB7-1.ELISA method was applied in measuring serum levels of IL-2,IL-6,IL-10,TGF-β and IFN-γ.ResultsThe ethyl acetate extract fromχihuangpills effectively inhibited the growth of Walker256 by 30.41%.Compared with the model control,serum levels of IL-2,IFN-γ andB7-1 were significantly higher(P＜0.05),and those of IL-6 and TGF-β were significantly lower(P＜0.05)in the high doseχihuangpill ethyl acetate extracs group.No significant difference in the level ofand IL-10 was found in the control.ConclusionThe ethyl acetate extracts fromχihuangpills is one of the active constituent parts for inhibition of tumor growth by elevating IL-2,IFN-γ and,B7-1 and reducing IL-6 and TGF-β.

Xihuangpill;Ethyl acetate extract;Mammary cancer;Tumor;Cytokine

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0303-04

2013-06-20

2013-07-22

*大連金州新區(qū)科技計劃(2012-A1-046)

馬杰(1988-),男,湖北十堰人,碩士,主要從事中藥抗腫瘤藥理研究。電話:0411-87403952,E-mail：429671086@qq.com。

梁文波,男,教授,研究方向:中藥抗腫瘤藥理。電話:0411-87403409,E-mail：dllwb@126.com。