劉媛，劉東伯，龍國賢，胡國清

(1.湖北省襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，襄陽 441000；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科，武漢 430030)

吉非替尼和依維莫司對EGFR-TKI耐藥鼻咽癌細胞的作用*

劉媛1，2，劉東伯2，龍國賢2，胡國清2

(1.湖北省襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，襄陽 441000；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科，武漢 430030)

目的 探討吉非替尼和依維莫司對吉非替尼耐藥鼻咽癌細胞的作用效果及分子作用機制。方法吉非替尼、依維莫司單獨或聯合作用人鼻咽癌細胞株HONE1后,采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞的增殖抑制,流式細胞術檢測細胞凋亡率及周期分布,Western blot檢測細胞磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化核糖體S6蛋白激酶(p-S6K)的表達水平。結果吉非替尼和依維莫司均呈濃度依賴性抑制HONE1細胞增殖,吉非替尼的半數抑制濃度(IC50)為17.92μmol·L-1,依維莫司的IC50為2.46 nmol·L-1,但二者聯合作用效果與單藥相比并未表現出明顯的優(yōu)勢(P> 0.05);吉非替尼對p-AKT抑制作用不明顯,依維莫司可下調p-S6K的表達,同時上調了p-AKT的表達,聯合用藥對p-S6K和p-AKT表達的抑制作用并不明顯強于單藥。結論吉非替尼和依維莫司聯合作用于吉非替尼耐藥鼻咽癌細胞株HONE1沒有表現出協同效應,表皮生長因子受體/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(EGFR/AKT)信號通路與雷帕霉素蛋白(mTOR)信號通路在鼻咽癌細胞中的關系有待進一步研究。

吉非替尼；依維莫司；癌,鼻咽；聯合用藥

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種地方性高發(fā)的惡性腫瘤,主要發(fā)生于東南亞地區(qū)和中國,特別是中國的廣東、香港、廣西、海南、福建等地,每年發(fā)病率(20～30)/100 000［1］,嚴重威脅人民身體健康。放射治療或同步放射治療化學治療(化療)是局部鼻咽癌的主要治療模式,對于遠處復發(fā)或轉移患者主要采用全身化療,但有效率低,不良反應大。小分子靶向藥物是目前治療鼻咽癌的研究熱點。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在超過80%的鼻咽癌患者中呈過表達,并與不良的臨床預后密切相關［2］。EGFR抑制藥分為兩類:一類是單克隆抗體,直接抑制胞外配體結合區(qū),如西妥昔單抗、尼妥珠單抗；另一類是小分子酪氨酸激酶抑制藥(tyrosine kinase inhibitor,TKI),抑制胞內酪氨酸激酶區(qū),如吉非替尼(gefitinib)。西妥昔單抗、尼妥珠單抗治療晚期鼻咽癌效果顯著,但是,吉非替尼的療效卻讓人失望［3］。研究顯示,鼻咽癌中絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(protein serine threonine kinases,AKT)相關的信號傳導通路呈持續(xù)活化狀態(tài),并參與了其對吉非替尼原發(fā)耐藥［4］。持續(xù)活化的AKT通過使底物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Chk1、MDM2、Bcl-xl/Bcl-2相關促凋亡因子BAD等磷酸化控制細胞進程,其中,mTOR相關信號通路的失控對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展最為重要［5-6］。研究顯示,聯合靶向EGFR和mTOR治療在肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中,均取得了良好的協同作用,mTOR抑制藥可以逆轉腫瘤細胞對EGFR-TKI的耐藥［7-10］。而聯合靶向EGFR和mTOR在鼻咽癌中的作用鮮見報道,筆者在本研究中探討EGFR-TKI吉非替尼和mTOR抑制藥依維莫司(everolimus)在鼻咽癌細胞HONE1中聯合應用的效果,并初步探討可能的分子作用機制,為鼻咽癌聯合靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 吉非替尼為阿斯利康公司惠贈；依維莫司為諾華公司惠贈；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購于Gibco公司；胰蛋白消化酶購于Sigma公司；一抗AKT、p-AKT(ser473)、S6K及p-S6K(thr389)單克隆抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗鼠及羊抗兔二抗購于Cell Signaling公司；噻唑藍(thiazolyl blue,MTT)試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司；細胞膜磷酯酰絲氨酸異硫氰酸熒光素凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司；增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色試劑盒購于GE Healthcare公司；酶標儀、電泳槽和轉膜儀購于Bio-Rad公司；流式細胞儀購于Beckman Coulter公司。

1.2 細胞培養(yǎng) HONE1為人鼻咽低分化鱗狀細胞癌細胞株,由中南大學腫瘤研究所曹亞教授饋贈。用含10%胎牛血清、100 U·m L-1青霉素和100 U·m L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,于5%二氧化碳(CO2)、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代,選對數生長期細胞進行實驗。

1.3 生長抑制率檢測 取對數生長期的HONE1細胞種于96孔板中,分別用不同濃度的吉非替尼(0.1, 1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μmol·L-1)和依維莫司(0.1,1.0,10.0,100.0,1 000.0 nmol·L-1)單獨處理或兩藥物聯合處理72 h。每孔加入MTT溶液20μL孵育4 h,當肉眼可見藍紫色的產物甲臜形成時,小心吸出孔內的MTT液,每孔加入二甲亞砜溶液(dimethyl sulfoxide,DMSO)100μL溶解甲臜結晶。于酶標儀內測定490 nm波長吸光度(A)值,根據公式,細胞生長抑制率=100%×(A對照-A實驗)/(A對照-A空白),繪制生長抑制-藥物濃度曲線。每孔設3個復孔,該實驗至少重復3次。

1.4 凋亡檢測 取對數生長期HONE1細胞種于6孔板中,分別加入吉非替尼1.0μmol·L-1、依維莫司1.0 nmol·L-1、吉非替尼1.0μmol·L-1聯合依維莫司1.0 nmol·L-1、同體積培養(yǎng)液處理48及72 h。用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的胰酶消化細胞,4℃預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗細胞2次,收集(1～5)×105的細胞,加入細胞膜磷酯酰絲氨酸異硫氰酸熒光素5μL混勻后,加入碘化丙啶溶液5μL混勻,室溫避光反應5～15 min,1 h內進行流式細胞儀檢測并用CellQuest軟件分析。該實驗至少重復3次。

1.5 細胞周期檢測 取對數生長期HONE1細胞種于6孔板中,分別加入吉非替尼1.0μmol·L-1、依維莫司1.0 nmol·L-1、吉非替尼1.0μmol·L-1聯合依維莫司1.0 nmol·L-1、同體積培養(yǎng)液處理48 h及72 h。用不含EDTA的胰酶消化細胞,4℃預冷PBS洗滌細胞1次,收集1×106的細胞,加入70%冷乙醇3 m L固定,-20℃過夜,4℃預冷PBS洗滌細胞1次,離心棄上清液,加入核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNaseA)100μL混勻后,37℃水浴30 min,再加入PI 400μL染色混勻,在4℃避光反應30 min,24 h內進行流式細胞儀檢測并用Mod-Fit TM for Mac version 3.0軟件分析。該實驗至少重復3次。

1.6 細胞蛋白表達檢測取 對數生長期的HONE1細胞種于培養(yǎng)瓶中,分別加入吉非替尼1.0μmol·L-1、依維莫司1.0 nmol·L-1、吉非替尼1.0μmol·L-1聯合依維莫司1.0 nmol·L-1、同體積培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱中孵育48 h。收集細胞,加入含蛋白酶和磷酸酶抑制藥的Buffer溶解細胞,4℃低溫離心,小心吸取蛋白上清液,移入預冷的離心管。BCA法檢測蛋白濃度,加入上樣緩沖液,置于沸水(95～100℃)5min使蛋白變性。十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白,用轉膜儀將蛋白轉移至硝酸纖維膜(nitrocellulose fiter membrance,NC膜)上,并將其置入4℃預冷5%脫脂奶中,室溫封閉1 h。分別用一抗孵育,4℃過夜,TBST漂洗NC膜5次,每次3 min。二抗孵育,室溫1 h,三羥甲基氨基甲烷緩沖液-聚山梨酯-80溶液漂洗NC膜5次,每次3min。ECL顯色法顯示相關蛋白影像,掃描底片并分析。該實驗至少重復3次。

1.7 作圖方法 實驗結果使用GraphPad Prism 5作圖軟件繪圖；在吉非替尼和依維莫司靶向位點不同并且不相關的前提下,用Bliss法研究藥物的聯合效果,其公式為:

E(χ)為一種藥物在濃度χ時的效果,E(y)為另一種藥物在濃度y時的效果,E(χ,y)即為兩藥的聯合效果。

1.8 統計學方法 實驗結果使用SPSS 11.5版數據分析軟件進行分析,t檢驗比較單藥組和聯合用藥組的差異,P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 藥物單獨或聯合處理對HONE1細胞生長影響

HONE1經不同濃度吉非替尼、依維莫司分別處理72 h后,進行MTT檢測并繪制生長抑制曲線,吉非替尼在HONE1中的半數抑制濃度為17.92μmol·L-1,依維莫司在該細胞中的半數抑制濃度為2.46 nmol· L-1,兩種藥物均呈現出劑量依賴性生長抑制。為檢驗聯合用藥的效果,將不同濃度吉非替尼分別與依維莫司(1.0 nmol·L-1)同時作用于細胞72 h,Bliss法求出預期聯合用藥效果,與實際聯合用藥效果比較,兩組數據沒有明顯的差別,說明聯合用藥沒有表現出協同作用。

2.2 藥物單獨或聯合處理HONE1前后細胞凋亡率的變化 吉非替尼、依維莫司單獨或聯合處理HONE1細胞48,72 h后,采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。見圖1所示,吉非替尼和依維莫司作用于細胞72 h后的凋亡率較48 h高,具有時間依賴性。但是,聯合用藥與單藥相比,在48 h組及72 h組均未表現出明顯的優(yōu)勢［48 h組:t(吉非替尼∶聯合用藥)=0.348,t(依維莫司∶聯合用藥)=0.245；72 h組:t(吉非替尼∶聯合用藥)=0.513,t(依維莫司∶聯合用藥)=0.265；P> 0.05］。

圖1 吉非替尼和依維莫司單獨或聯合作用48,72 h時HONE1細胞凋亡率

2.3 吉非替尼和依維莫司單獨或聯合處理HONE1前后細胞生長周期的變化 48及72 h后,流式細胞術檢測并分析對照組、吉非替尼組、依維莫司組及聯合用藥組細胞的周期變化,見圖2所示,吉非替尼組出現G0/G1期細胞阻滯,并且,這種現象在72 h較48 h更為明顯。作用48 h后,依維莫司組和對照組相比無明顯差異,但其在作用72 h后,亦可引起G0/G1期細胞阻滯。然而,無論是處理48 h或72 h,聯合用藥組的G0/G1期細胞阻滯效果雖略高于單獨用藥組,但均差異無統計學意義［48 h組:t(吉非替尼∶聯合用藥)= 0.789,t(依維莫司∶聯合用藥)=0.080；72 h組:t(吉非替尼∶聯合用藥)=0.171,t(依維莫司∶聯合用藥)=0.054；P>0.05］。

2.4 吉非替尼、依維莫司單獨或聯合作用對通路蛋白的影響 Western blot檢測吉非替尼、依維莫司單獨或聯合用藥處理48 h后,HONE1細胞胞漿內p-AKT及p-S6K的表達情況。見圖3,吉非替尼沒能抑制AKT及S6K的磷酸化,依維莫司可下調p-S6K的表達,但是,它同時也上調了p-AKT的表達。聯合用藥時,p-AKT的表達水平與單藥吉非替尼相似,并能抑制S6K的活化。

3 討論

EGFR信號通路與mTOR信號通路密切相關［5］,越來越多研究顯示,通過聯合靶向EGFR和mTOR抑制藥阻斷下游信號通路,可以更全面地抑制腫瘤細胞的生長及促進周期阻滯,從而更好地發(fā)揮藥物的抗腫瘤效果［11］。EGFR與mTOR抑制藥聯合抗腫瘤的臨床研究已顯示出令人鼓舞的療效［12-13］。

圖2 吉非替尼和依維莫司單獨或聯合作用48,72 h時HONE1細胞周期分布

本研究發(fā)現,吉非替尼在鼻咽癌細胞株HONE1中的半數抑制濃度為17.92μmol·L-1,遠遠高于臨床試驗中吉非替尼研究劑量所能達到的血漿藥物濃度［14］,可以認為該細胞對吉非替尼耐藥。Western blot實驗結果顯示吉非替尼抑制p-AKT效果不佳,這也從分子水平證實了HONE1對吉非替尼耐藥,且其機制與p-AKT“逃逸”相關,這同以往吉非替尼在鼻咽癌中的研究結果一致［4］。

研究顯示,在非小細胞肺癌、淋巴瘤等細胞中,依維莫司主要通過誘導G0/G1期細胞周期阻滯抑制腫瘤細胞生長,而引起細胞凋亡的作用甚微［15-16］。但也有研究顯示在卵巢癌、非小細胞肺癌及神經膠質瘤細胞株中,依維莫司抑制細胞生長與誘導凋亡相關［17-18］。MA等［19］開展的一項基礎研究發(fā)現依維莫司可以通過誘導細胞凋亡抑制鼻咽癌細胞株的生長,但不引起細胞周期阻滯。然而,本研究結果顯示,依維莫司既能誘導HONE1細胞凋亡,又可以引起細胞G0/G1期阻滯,兩種作用效果均呈時間依賴性。值得一提的是,本實驗中依維莫司對細胞周期的作用在72 h后才表現出來,而MA等［19］的實驗中依維莫司僅作用了24 h,這可能是導致不同結果的主要原因。為了更深入地了解依維莫司在HONE1中的作用機制,筆者檢測了藥物作用下信號通路上幾種關鍵蛋白的表達,結果發(fā)現依維莫司在抑制p-S6K活化的同時明顯上調p-AKT的表達,這種現象在其他腫瘤的研究中也有發(fā)現,可能與依維莫司誘導IGF-1/IGF-1R/PI3K/AKT信號通路激活有關［20］。

圖3 吉非替尼和依維莫司單獨或聯合處理48 h對PI3K/AKT/m TOR信號通路的影響Fig.3 Effect of 48-hour treatment w ith gefitinib and everolimus alone or in combination on PI3K/AKT/m TOR signaling pathway

進一步研究結果顯示,聯合用藥在抑制細胞生長、促進細胞凋亡、誘導細胞周期阻滯及抑制通路蛋白活化中的作用與單藥相比差異無統計學意義,mTOR抑制藥依維莫司并不能逆轉鼻咽癌細胞HONE1對吉非替尼的耐藥性。其原因可能包括以下兩點:首先, Rictor-mTOR復合物(即mTORC2)使AKT的Ser473位點磷酸化,它可以促進PDK1識別并活化AKT的Thr308位點,從而使AKT完全激活。mTOR抑制藥雖然不能特異性結合Rictor-mTOR復合物,但是,長期作用時仍能干擾Rictor-mTOR復合物的功能,抑制AKT活化［21］。超過20%的腫瘤細胞具有這種特性,它具有細胞類型依賴性和時間依賴性［22］。本研究中聯合用藥最長時間為72 h,雖然在一些腫瘤中表現出了明顯的效果［10,23］,但似乎在HONE1細胞中效果不佳。這可能是因為作用時間不夠,或者,HONE1根本不具備這種特性。其次,有報道稱,盡管EGFR/PI3K/AKT信號通路在鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展中極為重要,但是,它主要是通過下游的BAD、FKHR/FOXO信號分子或細胞周期負調控因子p21和p27發(fā)揮作用,p-mTOR的表達不受AKT的調節(jié),EGFR/AKT/mTOR這種簡單的線性模式并不適用于鼻咽癌［24-25］。

綜上所述,吉非替尼和依維莫司聯合作用于鼻咽癌細胞株HONE1并未表現出明顯的協同效應,依維莫司不能逆轉吉非替尼耐藥鼻咽癌細胞株HONE1的耐藥性,EGFR/AKT信號通路與mTOR信號通路在鼻咽癌細胞中的關系有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.012

Effect of Gefitinib and Everolimus on Nasopharyngeal Carcinoma Cells Resistant to Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinases Inhibitor(EGFR-TKI)

LIU Yuan1,2,LIU Dong-bo2,LONG Guo-xian2,HU Guo-qing2
(1.Department ofOncology,Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441000,China;2.Department of Oncology,Tongji Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To investigate the synergistic effect and molecular mechanism of the epidermal growth factor receptor(EGFR)inhibitor gefitinib and the mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibitor everolimus on nasopharyngeal carcinoma resistant to gefitinibin vitro.MethodsHuman nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 were incubated with gefitinib and everolimus alone and in combination,the effect of cell growth inhibition was measured by MTT assay.Flow cytometry was applied to assess the cell cycle and apoptosis.Western blot was used to detect the expression of phosphorylated levels of protein serine threonine kinases(p-AKT)and ribosomal S6 kinases(p-S6K)in cells.ResultsThe effects of cell growth inhibition by gefitinib or everolimus separately were dose-dependent in the HONE1 cell line.The IC50value for gefitinib was 17.92μmol·L-1,and that for everolimus was 2.46 nmol·L-1.However,the combination of two agents did not show a obvious advantage over the drug used alone(P>0.05).The inhibition of p-AKT expression was not remarkable in the HONE1 cell line after gefitinib treatment.Everolimuswas revealed to down-regulate the expression of po-S6K and up-regulate the level of p-AKT in the HONE1 cell line.Moreover,no stronger inhibitory effect on p-S6K and p-AKT expression by combined agentswas found.ConclusionCombined treatmentof gefitinib and everolimus doesn’t show a synergistic effect against nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 resistant to gefitinib.Further research is in need to investigate the relationship between the EGFR/ AKT signaling pathway and themTOR signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma cells.

Gefitinib;Everolimus;Carcinoma,nasopharyngeal;Combination therapy

R979.1;R965

A

1004-0781(2014)01-0043-06

2013-07-25

2013-10-22

*吳階平醫(yī)學基金資助項目(320.6700. 09065)；國家自然科學基金資助項目(81272491)

劉媛(1987-),女,湖北荊州人,住院醫(yī)師,碩士,主要研究方向:腫瘤診斷與綜合治療。電話：0710-3229190,E-mail：susan746@126.com。

胡國清(1954-),男,湖北荊州人,主任醫(yī)師,博士,主要研究方向:腫瘤診斷與綜合治療。電話：027-63089802,E-mail：gqhu@tjh.tjmu.edu.cn。