李 強，夏 靜，吳春敏，張 巖

（河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

在《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中，將保健食品的功能劃分為27類［1，2］，這其中包括輔助降血糖功能。貨真價實的保健品確實有輔助治療的效果，但是，一些不法商販利欲熏心，不擇手段，向保健品中非法添加化學(xué)藥品，尤其面對老年人常見疾病高血壓、糖尿病的保健品，打著純天然保健的旗號，偷偷在保健食品中非法添加鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、鹽酸吡格列酮、格列苯脲和格列齊特等化學(xué)藥品［3－8］，此類藥物的原料藥價格低廉，卻被冠以“新藥特藥”之名，極大的擾亂了保健食品市場并傷害了消費者的健康［9］。

國家食藥局對于保健食品中摻加化學(xué)藥物的情況十分重視，并多次進行了專項打假行動。但我國目前尚未頒布保健品中摻加降糖類化學(xué)藥物的有效甄別方法，使得一些執(zhí)法行動缺少技術(shù)依據(jù)［10，11］。本實驗正是針對常見11種常見降糖藥進行檢測分析研究，并建立一種方法簡便、準(zhǔn)確率高、靈敏度高的新方法，以期為整頓保健食品的安全有序的市場氛圍提供技術(shù)保障和支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC－TOF－MS系統(tǒng)（AB SCIEX TripleTOFTM5600）；超聲波清洗器；超速冷凍離心機；全自動氮吹濃縮儀。

11種降糖藥對照品：二甲雙胍（Metformin Hydrochloride）、苯乙雙胍（Phenformin）、格列美脲（Glimepiride）、格列本脲（Glibenclamide）、格列吡嗪（Glipizide）、格列齊特（GLICLAZIDE）、吡格列酮（Pioglitazone）、格列喹酮（Gliquidone）、羅格列酮（Rosiglitazone）、瑞格列奈（Repaglinide）、那格列奈（Neteglinide）。均購自中國食品藥品檢定研究院。

檢測樣品為8種適用于糖尿病人和高血壓病人食用的保健品，購自當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取11種藥品的對照品各10mg于10mL容量瓶中用甲醇溶解，配制成1mg／mL的單標(biāo)儲備液，再分別準(zhǔn)確吸取1mg／mL的11種單標(biāo)儲備液各1mL于100mL的容量瓶中，用甲醇定容得到10mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時用流動相將混標(biāo)溶液稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

1.3 樣品前處理

稱取1.0g固體試樣或移取5mL液體試樣于50mL塑料離心管中，固體試樣需加3－5mL水進行分散，待分散均勻后加入15mL甲醇，漩渦振蕩器中混勻并超聲提取15min，以12000r／min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液于50mL容量瓶中，離心管中殘渣再用15mL甲醇渦旋混勻并超聲提取后，以12000r／min離心5min，合并上清液于容量瓶中，加水定容至50mL，取上清液過0.22μm微孔濾膜，濾液待測。如需稀釋上機，需采用50%甲醇水溶液進行稀釋操作。

1.4 色譜條件

色譜柱為Phenomenex kinetex 2.6μm C18 100A100＊2.1mm；流動相：正模式下為：5mmol／L乙酸銨溶液和0.5%甲酸乙腈；負模式時：5mmol／L乙酸銨溶液和乙腈；梯度洗脫條件見表1，進樣量為5μL。

表1 梯度洗脫條件

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧電離離子源（ESI）；電離方式為正離子掃描：電離電壓5500V，霧化氣50，輔助加熱氣60，輔助氣溫度550℃；檢測模式：飛行時間全掃描質(zhì)譜和二級質(zhì)譜模式；TOF－MS掃描范圍為m／z100～1000，TOF－MS觸發(fā)二級掃描范圍 m／z100～1000，去簇電壓（DP）80V，碰撞能量（CE）10eV；擴展碰撞能量（CES）15eV。

在上述條件下獲得的二級質(zhì)譜譜圖，建立了11種違禁藥物的MS／MS數(shù)據(jù)庫，包括分子式、相對分子質(zhì)量、CAS編號、化學(xué)名等詳見表2。

1.6 定性篩查與定量檢測

應(yīng)用軟件中的XIC Manager功能處理采集的數(shù)據(jù)，根據(jù)保留時間和質(zhì)量準(zhǔn)確度，同位素分布以及譜庫檢索進行定性分析；再以提取一級母離子的峰面積進行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化

實驗中分別在正模式下考察了11種待測物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)，考察了乙腈（0.1%甲酸）、乙腈、甲醇（0.1%甲酸）和甲醇作為流動相中有機相對于目標(biāo)化合物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)進行正模式掃描11種目標(biāo)物質(zhì)時，流動相為乙腈（0.1%甲酸）時，各種物質(zhì)儀器響應(yīng)值明顯高出其他三種有機相的流動相，這是由于甲酸提供的質(zhì)子更有利于正模式下各物質(zhì)的離子化，對色譜分離用的梯度洗脫程序進行優(yōu)化，并使其運行時間控制在9min內(nèi)完成34種化合物的分析工作。

表2 11種降糖藥物的信息表

2.2 提取方法的優(yōu)化

本實驗中的11種化合物均在甲醇或乙腈中具有良好的溶解性，遂考察了不同含量的甲醇水溶液和不同含量的乙腈水溶液對于保健品樣品中目標(biāo)物質(zhì)的提取效果。結(jié)果表明，有機相的比例越高，對于目標(biāo)物的提取越好。再綜合比較甲醇和乙腈在質(zhì)譜中的霧化效果及經(jīng)濟環(huán)保性，最終選擇了100%甲醇作為提取試劑，樣品的前處理較為簡便易操作。同時還考察了采用超聲提取方式用10?0%甲醇在10、15、20、25、30min不同時間的提取效果。結(jié)果顯示超聲提取20min為最適宜的時間，雜質(zhì)提取率低，可滿足后續(xù)試驗中的凈化需求。

2.3 質(zhì)譜定性篩查和定量分析

依據(jù)本研究中優(yōu)化的最佳試驗條件，將濃度為50μg／kg的混合標(biāo)準(zhǔn)品進入系統(tǒng)，儀器掃描得到的一級母離子提取離子流圖（圖1），以及二級高分辨質(zhì)譜圖（圖2）。通過對一級和二級譜圖中主要特征碎片離子以及保留時間等信息提取并建立了篩查譜庫。為了驗證篩查譜庫的準(zhǔn)確性，采用空白加標(biāo)的方式，依據(jù)高精度質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素峰分布及特征碎片離子等參數(shù)同譜庫進行匹配比對。結(jié)果顯示，該加標(biāo)樣品中11種化合物均具備較高的匹配度。

2.4 方法的線性關(guān)系及定量限

配置不同濃度的11種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以各目標(biāo)物質(zhì)的峰面積和質(zhì)量濃度進行線性回歸計算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3，可見其線性關(guān)系良好，以定量離子的3倍信噪比的響應(yīng)值對應(yīng)的化合物濃度作為儀器的檢出限。吡格列酮、格列齊特、格列吡嗪、格列苯脲、苯乙雙胍、格列美脲的線性范圍為10～1000μg／L；那格列奈、二甲雙胍、瑞格列奈、羅格列酮、格列喹酮的線性范圍為2～500μg／L。

圖1 11種降糖藥物的一級母離子提取流圖

續(xù)前

圖2 11種降糖藥物的二級碎片離子譜圖

2.5 回收率與精密度

按照本實驗條件，選擇一陰性樣品基質(zhì)進行3個水平的加標(biāo)回收實驗，每個添加水平平行測定（n）6次，回收率和精密度實驗結(jié)果如表4所示。3個添加水平的回收率在72.3%～118.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～8.1%。可以看出該實驗方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表3 11種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表4 實際樣品加標(biāo)回收率和相對偏差

2.6 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對實際樣品進行測定，共選取了9個樣品，其中只有1個樣品中檢出了二甲雙胍，其含量為15.7μg／kg。使用了軟件中XIC Manager功能進行譜庫的比對，其得分為92.1，具有較高的匹配度，可以用于普通保健品的篩查定性和定量。

3 結(jié)論

本實驗建立了高效液相色譜－離子阱飛行時間高分辨質(zhì)譜法對保健品中降糖及降壓類藥物的快速篩查和確證的方法，樣品提取方便快捷，可同時獲取一級和二級精確質(zhì)量數(shù)譜圖。利用精確質(zhì)量數(shù)、理論同位素比例分布、保留時間構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫進行了定性篩查，以提取的一級母離子進行定量分析，可以實現(xiàn)較短時間的快速分析和測定，對于不完善的保健品市場中添加違禁藥物的現(xiàn)象的杜絕起到一定的監(jiān)管力量，也同時為打擊非法添加違禁藥物的市場現(xiàn)狀起到了約束和預(yù)防的作用。

［1］ 朱峰，阮麗萍，馬永建，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測降糖類和減肥類保健品中20種非法添加的化學(xué)降糖藥物［J］.色譜，2014，32（1）：13－20.

［2］ 郭棟，那順朝克圖，王江華，等.高效液相色譜法測定降糖中成藥中添加的高極性化學(xué)降糖藥物［J］.色譜，2009，27（2）：211－215.

［3］ 吳公平，雷玉萍，李榮瑋，李慧敏.采用反相高效液相色譜法測定降糖類保健食品非法添加降糖化學(xué)藥品檢驗方法的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（9）：1380－1382.

［4］ 鈕正睿，張慶生，曹進，顧雪竹.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測保健食品中非法添加的6種減肥類化學(xué)成分的研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（18）：91－93.

［5］ 胡青，崔益泠，張甦.液相色譜－離子阱質(zhì)譜聯(lián)用測定抗高血壓類中藥及保健品中15種非法摻加化學(xué)藥品的研究［J］.中成藥，2008，30（7）：1207－1208.

［6］ 王柯，胡青，崔益泠，季申.液相色譜－離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測減肥類中藥及保健食品中28種非法摻加藥物的研究［J］.藥物分析雜志，2008，28（8）：1268－1269.

［7］ 高青，張喆，戴紅，車寶泉，郭洪祝.中藥制劑及保健品中違禁添加降壓藥物的LC－MS／MS定性檢測［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（5）：364－365.

［8］ 魏清芳，王嘉林.液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定中藥及保健品中非法添加8種化學(xué)降糖藥［J］.中國藥事，2011，25（1）：70－72.

［9］ 葛文超，湯慧，張萍，金建平，吳靜.高效液相色譜法同時測定鎮(zhèn)靜安神類中成藥及保健食品中非法添加5種西藥成分［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14（9）：1018－1019.

［10］ 王靜文，黃湘鷺，曹進，王鋼力，張慶生，丁麗霞.超高效液相色譜法同時測定減肥類保健食品中非法添加的25種藥物［J］.色譜，2014，32（2）：151－156.

［11］ 王靜文，曹進，王鋼力，張慶生，丁麗霞.保健食品中非法添加藥物檢測技術(shù)研究進展［J］.藥物分析雜志，2014，34（1）：1－2.