張曉光，鄭雅梅，李 強，楊 剛，張 巖

（1.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050091；2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對保健食品的需求量逐年增大，不法商販為了追求更高利益，向保健品中違法添加西藥類物質(zhì)屢見不鮮。糖皮質(zhì)激素具有廣泛的臨床用途，因而成為不法商家在保健品中非法添加的目標物質(zhì)，如果誤食了非法添加含有糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)的保健食品，可能會導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)，造成人體機體代謝紊亂、發(fā)育異常或潛在致畸致癌風(fēng)險［1－2］。由此可見，加強對保健品中非法添加的監(jiān)管，建立保健品中激素類檢測方法十分必要。

精確先進的激素測定方法是實現(xiàn)激素殘留有效監(jiān)督的重要手段，目前，激素類物質(zhì)的檢測方法主要有高效液相色譜法［3－5］、毛細管色譜法［6］、薄層色譜法［7］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［8］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［9－11］等。本文介紹了一種超聲萃取－超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法能快速分析檢測保健食品中10種糖皮質(zhì)類類西藥成分，該方法主要的優(yōu)勢在于檢測時間短，方法準確、簡便快速，能夠為保健品的檢驗工作和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器，試劑與材料

Thermo TSQ Vantage液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純（德國Merck公司）；無水硫酸鎂（分析純，天津富宇試劑公司）；N－丙基乙二胺吸附劑PSA（天津博納艾杰爾公司）；實驗用水為實驗室自制，符合GB／T 6682一級水的標準。

化學(xué)降糖藥物標準品：潑尼松、氫化可的松、曲安西龍雙醋酸酯、倍他米松、氟米龍、氟氫縮松、甲基潑尼松龍醋酸酯、氫化可的松丁酸酯、氫化可的松戊酸酯、倍他米松雙丙酸酯購于中國食品藥品檢定研究院。

實驗用保健品產(chǎn)品共計30份，均購于石家莊某超市。

1.2 標準儲備液制備

分別將10種糖皮質(zhì)類化合物用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1mg／mL的標準儲備液，使用時用乙腈稀釋成所需的標準工作溶液，－20℃冰箱保存。

1.3 樣品處理

稱取1.0g（精確至0.01g）樣品于50mL具塞離心管中，加入乙腈10mL，渦旋混勻，再加入2.0g無水硫酸鎂和100mgPSA，渦旋混勻后超聲萃取20min，于4℃、10000r／min條件下離心5min，收集上清液并移至圓底燒瓶，42℃減壓蒸發(fā)至近干。以10% 乙腈水溶解濃縮物，定容至1.0mL，過0.22μm 濾膜，供上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件：

色譜柱：Thermo Hypersil Gold（50mm×2.1mm，1.9μm）

流動相：A相0.1%（V／V）甲酸水溶液；B相乙腈；梯度洗脫：0－1min，90%A；1－8min，90%－10%A；8－10min，10%A；10－11min，10%A－90%A；11－14min，90%A。流速：0.30mL／min；柱溫：30℃；進樣量：1μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件：

電噴霧離子源（ESI）溫度：350℃；

毛細管電壓：4000V（正離子模式）；

掃描范圍：m／z 100～800（正離子模式）；

氣化溫度：300℃；

鞘氣壓（N2）：30arb；

輔助氣壓（N2）：10arb；

離子傳輸管溫度：350℃；

碰撞裂解氣：高純氬氣；

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法的優(yōu)化

實驗采用有機溶劑進行超聲提取，比較了乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷等4種有機溶劑，以確定本實驗用的提取有機溶劑。分別選用以上四種溶劑作為提取劑和不同的提取時間（5、10、15、20、30min），對實際樣品進行加標回收實驗（加標量為10μg／kg），比較回收率、本底干擾及可操作性綜合評價提取溶劑的效果。實驗結(jié)果表明：乙腈的提取回收率最高，基質(zhì)干擾最小，效果最好。當超聲時間為20min時，目標物提取回收趨于穩(wěn)定，均能獲得70－115%的回收率。因此實驗最終選擇乙腈為提取溶劑，超聲時間為20min。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

由于保健品中用乙腈提取所得提取物基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此需對提取液進行凈化處理，實驗考察對比了固相萃取柱法和基質(zhì)固相分散法的兩種凈化效果，以基質(zhì)加標回收率的高低作為萃取凈化方法評價指標。結(jié)果表明，使用HLB固相萃取柱凈化得到了較好的效果，10種糖皮質(zhì)激素平均回收率達到75%以上，降低了基質(zhì)效應(yīng)；使用基質(zhì)固相分散萃取法，能夠有效地去除樣品基質(zhì)中的色素、脂類、醚類、金屬離子等雜質(zhì)，回收率與使用HLB固相萃取相比，平均回收率無明顯差異，但是平均回收率RSD值較高，這可能是由于PSA填料結(jié)構(gòu)為N－丙基乙二胺，對一些糖皮質(zhì)激素具有吸附作用，但是與使用固相萃取柱HLB相比，基質(zhì)分散固相萃取操作更加簡便，使用的提取劑用量少，操作更加簡便，因此本實驗最終選取PSA凈化方法。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)10種糖皮質(zhì)激素化合物的化學(xué)電離性質(zhì)，分別選用正模式掃描和負模式掃描作為離子化模式，采用流動注射泵連續(xù)進樣方式進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，在實驗結(jié)果表明10種糖皮質(zhì)類激素物質(zhì)在正模式和負模式均有響應(yīng)，在正模式下形成［M＋H］、［M＋Na］峰、在負模式下形成［M－H］峰，其中10種糖皮質(zhì)激素在正模式下的［M＋H］峰的豐度最高，因此本實驗確定以正模式掃描，以［M＋H］來確定10種糖皮質(zhì)激素的母離子，在確定糖皮質(zhì)激素的母離子后，采用子離子掃描方式對子離子進行了優(yōu)化選擇，每個母離子確定了2對子離子。通過優(yōu)化碰撞能量、透鏡電壓等質(zhì)譜參數(shù)使每種激素的特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大。確定碰撞能量和透鏡電壓后，連接液相色譜和三重四級桿質(zhì)譜儀聯(lián)機，對離子源溫度、毛細傳輸管溫度、鞘氣流量、輔助氣流量進行優(yōu)化，使樣液中每種激素的離子化效率達到最佳。10種激素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 10種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.4 色譜流動相的選擇

液相色譜質(zhì)譜儀在正模式下常用的流動相體系有甲酸水溶液（甲酸含量0.1%v／v）－甲醇體系、甲酸水溶液（甲酸含量0.1%v／v）－乙腈體系、乙酸銨水溶液（乙酸銨含量5mmol／L）－乙腈體系、乙酸銨水溶液（乙酸銨含量5mmol／L）－甲醇體系等，考察了以上四種流動相體系下，質(zhì)譜出峰的情況。經(jīng)過試驗表明，不同流動相對質(zhì)譜出峰影響較大，其中有機相使用乙腈體系得到的峰影響強度均大于甲醇體系，且基質(zhì)干擾明顯小于使用甲醇體系，水相中使用乙酸銨比使用甲酸得到的峰形更好，這可能是因為使用乙酸銨有利于目標物的分子離子化，改善化合物的峰形。但是使用乙酸銨水溶液作為水相得到的10種糖皮質(zhì)激素平均峰強度比使用甲酸水溶液得到的10種糖皮質(zhì)激素平均峰強度小1／2左右，這可能是由于甲酸使正離子模式下的目標物質(zhì)子化增強，但同時也增加了糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)在流動相中的保留能力，導(dǎo)致峰形變寬。綜合考慮目標物的以上幾點，本實驗最終確定以甲酸水溶液（甲酸含量0.1%v／v）－乙腈體系作為流動相，優(yōu)化后的目標物MRM色譜圖見圖1。

圖1 10種糖皮質(zhì)激素的MRM色譜圖

（從上到下依次為潑尼松Prednisolone、氫化可的松Hydrocortisone、曲安西龍雙醋酸酯Triamcinolone acetonide、倍他米松Betamethasone氟米龍Fluoromethalone、氟氫縮松Fludroxycortide、甲基潑尼松龍醋酸酯Methylprednisolone 21－acetate、氫化可的松丁酸酯Hydrocortisone 17－butyrate、氫化可的松戊酸酯Hydrocortisone 17－valerate、倍他米松雙丙酸酯Betamethasone dipropionate）

2.5 方法準確度和精密度

以10種糖皮質(zhì)激素物質(zhì)標準品的峰面積為縱坐標，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（ng／mL）為橫坐標，進行線性回歸計算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。10種分析物的線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3倍信噪比（S／N）為檢出限（LOD），10倍信噪比（S／N）為定量限（LOQ）。各目標物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表2。

表2 10種目標物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 方法的回收率

在空白基質(zhì)中添加10種降壓藥物標準溶液，添加水平分別為1μg／kg、3μg／kg和10μg／kg，每個添加水平平行測定3次，用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定，其回收率和精密度結(jié)果列于表3。10種目標物在3種添加水平下的加標回收率在71.4%～113.5%之間，相對標準偏差為2.1%－13.6%。

表3 實際樣品的加標回收率和相對偏差

續(xù)表3

2.7 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對市場上銷售的保健類產(chǎn)品共30份進行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1份功能性保健食品中含有0.20mg／kg的倍他米松。

3 結(jié)論

建立了同時快速測定降糖類保健食品中的10種違禁添加成分的UPLC－MS／MS方法，通過優(yōu)化液相條件和質(zhì)譜條件，有效地提高了分析效率和靈敏度，縮短了檢測的時間（在6min內(nèi)能夠完成10種藥物的檢測），降低了檢出限，擴大了線性范圍。方法的樣品前處理步驟簡單，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，回收率符合方法學(xué)要求。該方法可以用于保健食品中糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)非法添加的檢測。

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