李述剛，白露，陸健康，許倩

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾843300）

紅棗具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值及藥用價(jià)值，素有“木本糧食、滋補(bǔ)佳品”的美譽(yù)。是集藥、食、補(bǔ)三大功能為一體的保健果品[1]。由于紅棗不耐貯藏，大多以鮮棗銷售，加工率較低，其附加值一直不高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在棗果由白轉(zhuǎn)紅的過程中，由于各種自然性災(zāi)害天氣的影響，常常出現(xiàn)豐產(chǎn)不豐收的現(xiàn)象，僅收棗季節(jié)陰雨連綿就造成爛棗率高達(dá)20%～40%[2]。鑒于紅棗易腐爛霉變，保鮮難度大的特點(diǎn)，紅棗除少量鮮用外，大部分在短期內(nèi)制成干品。目前，我國(guó)紅棗種植戶和加工企業(yè)主要采用自然干制、熱風(fēng)干制和微波干制等方法，其中大部分紅棗仍采用自然晾曬，由于紅棗果皮往往覆蓋一層蠟質(zhì)，這賦予了干棗產(chǎn)品特有的品質(zhì)，使其表皮光亮、美觀，極大提高其商品價(jià)格和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。然而往往因?yàn)榧t棗果皮覆蓋的這一層致密蠟質(zhì)層，會(huì)明顯阻礙果實(shí)內(nèi)部水分的蒸發(fā)[2]，使干燥時(shí)間延長(zhǎng)，大量鮮果因干燥時(shí)間過長(zhǎng)而霉變腐爛，造成浪費(fèi)。

植物表皮蠟質(zhì)組成成分復(fù)雜，物種不同蠟質(zhì)的組成成分也不同，蠟質(zhì)主要是由碳原子數(shù)在20～34碳之間的特長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物（包括烷烴、醇、醛、脂肪酸和酯等）組成，還包括萜類和其他微量次級(jí)代謝物如固醇和類黃酮類物質(zhì)[3]。為客觀揭示南疆灰棗果皮蠟質(zhì)成分，本課題擬采用溶劑萃取法對(duì)紅棗表皮蠟質(zhì)進(jìn)行提取，并通過氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）對(duì)南疆灰棗果皮蠟質(zhì)粗提物進(jìn)行初步分析，以探索灰棗果皮蠟質(zhì)組成，為生產(chǎn)加工中紅棗果皮蠟質(zhì)的保護(hù)或脫除提供參考，為紅棗保鮮和干制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

南疆灰棗：2011年9月采摘自塔水處水工二連，九成熟。

1.1.2 儀器

752N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ－D循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BS210S電子天平：北京賽多利斯儀器公司；Trace－DSQ氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)熱電公司，等。

1.1.3 試劑

三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、重鉻酸鉀、吡啶、N，O－雙（三甲基硅烷基）、三氯乙酰胺（BSTFA）等，所有試劑均為分析純。

1.2 蠟質(zhì)提取工藝

1.2.1 工藝流程

原料選擇→原料處理→溶劑提取→抽真空干燥→蠟質(zhì)粗提物

1.2.2 工藝要點(diǎn)

原料選擇及預(yù)處理：選擇大小均勻，成熟度一致，無(wú)裂痕無(wú)病蟲害和無(wú)機(jī)械損傷，品質(zhì)優(yōu)良的棗?；覘棽烧?，立即放入4℃冷庫(kù)中保鮮，取一部分棗洗凈晾干，裝入保鮮袋放入冰箱中待用。

溶劑提?。簩⑻幚磉^的棗放置在一定提取溶液的燒杯中，輕微攪拌并保持一定的時(shí)間，注意這個(gè)過程中不可破壞棗的表皮，此操作需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。

抽真空干燥：將提取后的溶液在密閉容器中進(jìn)行抽真空干燥，除去三氯甲烷等提取溶劑，此操作在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。

蠟質(zhì)粗提物：有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，用恒重法再次稱量燒杯，直至質(zhì)量保持恒定，再用差量法求得提取的蠟質(zhì)質(zhì)量。

1.3 方法

1.3.1 蠟質(zhì)成分定性分析[4]

由于蠟質(zhì)與重鉻酸鉀反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生顏色變化，而分光光度計(jì)能檢測(cè)出這種變化，所以選用分光光度計(jì)對(duì)蠟質(zhì)成分進(jìn)行定性檢測(cè)。檢測(cè)方法如下：將40 mL去離子水和20 g粉末狀的重鉻酸鉀混合，再加入1L的濃硫酸（用量可根據(jù)比例調(diào)整），加熱直到溶液無(wú)懸浮顆粒及沉淀為止。在每個(gè)燒杯（含抽干后的蠟質(zhì)）中加入5 mL重鉻酸鉀溶液，冷卻后，加入12 mL去離子水，等待10 min讓其反應(yīng)。然后用分光光度計(jì)在590 nm的波長(zhǎng)下下進(jìn)行光密度分析，確定蠟質(zhì)成分的含量。

1.3.2 GC－MS分析蠟質(zhì)成分

1.3.2.1 樣品預(yù)處理

在GC－FID和GC－MS分析之前，羥基和羧基要通過和N－O雙三甲基硅基三氟乙酰胺在吡啶條件下（30 min，70℃）反應(yīng)，被轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的三甲基硅烷基衍生物。

1.3.2.2 分析條件

分析前將蠟質(zhì)溶于三氯甲烷，使蠟質(zhì)濃度為10 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)采用DB－5毛細(xì)管色譜柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm。實(shí)驗(yàn)參考王美芳等[5]的方法并改進(jìn)，具體條件如下：色譜條件：起始柱溫50℃，保持1 min，以20℃/min升溫至170℃保持2 min，以5℃/min升至300℃保持8 min，載氣為He，流速1.2 mL/min分流比1∶10，進(jìn)樣口溫度280℃，傳輸線溫度280℃；質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描范圍 50 amu～650 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑確定

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Shu－Jun Xu[6]和王美芳[5]的研究，選擇三氯甲烷，二氯甲烷，正己烷做為提取溶劑，提取時(shí)間為20 s，溶劑添加量為20 mL，以確定蠟質(zhì)提取的最佳溶劑，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在相同條件下，不同溶劑提取量不同，其中提取量最大的是二氯甲烷為43.2 mg/100 g，最小的是正己烷4.0 mg/100 g，因此，本實(shí)驗(yàn)確定二氯甲烷為最佳提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)蠟質(zhì)提取量的影響Fig.1 The effect of different extraction solvents on the extraction of jujube epicuticular wax

2.2 溶劑添加量確定

根據(jù)周小云等人[7]的研究，以三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷為提取溶劑，在提取時(shí)間為20 s時(shí)，選取溶劑添加量分別為 15、20、25、30、35 mL，以確定蠟質(zhì)提取的最佳溶劑用量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溶劑添加量對(duì)蠟質(zhì)提取量的影響Fig.2 The effect of different extraction solvents volume on the extraction of jujube epicuticular wax

由圖2可知，隨著溶劑添加量的增加，蠟質(zhì)提取量有所增加，當(dāng)溶劑添加量達(dá)到20 mL時(shí)，再增加溶劑添加量，蠟質(zhì)提取量上升效果不明顯，所以實(shí)驗(yàn)過程中選取20 mL為最佳溶劑用量。

2.3 溶劑混合比例確定

在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取提取時(shí)間為20 s，提取劑量為20 mL，3種提取溶劑三氯甲烷∶二氯甲烷、三氯甲烷∶正己烷、二氯甲烷∶正己烷，每種分別按照 1∶2、1∶1、2∶1的體積比混合提取蠟質(zhì)，以期獲得最佳溶劑混合比例。

結(jié)果表明，三氯甲烷與二氯甲烷混合使用效果最好，可明顯增強(qiáng)溶劑的浸提率，混合后的提取量從大到小的比例為：1∶2（53.7 mg/100 g）、1∶1（52.8 mg/100 g）、2∶1（51.0 mg/100 g），三氯甲烷與正己烷混合的提取結(jié)果分別為8.5、15.8、28.3 mg/100 g；而二氯甲烷與正己烷混合后提取結(jié)果分別為12.3、25.2、33.5 mg/100 g。由此可以看出三氯甲烷與二氯甲烷混合比例為1∶2時(shí)提取效果最好。

2.4 提取時(shí)間確定

根據(jù)鄭喜清等[8]的研究選擇20 s到60 s作為本實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間。在溶劑用量20 s、溶劑三氯甲烷：二氯甲烷體積比為1∶2的條件下，分別設(shè)置提取時(shí)間為20、40、60、80、100 s，最終確定最佳提取時(shí)間，結(jié)果如圖 3所示。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)蠟質(zhì)提取量的影響Fig.3 The effect of different extraction times on the extraction of jujube epicuticular wax

由圖3可知隨著時(shí)間的增加蠟質(zhì)質(zhì)量逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 s時(shí)灰棗表皮蠟質(zhì)基本溶出，再增加時(shí)間蠟質(zhì)提取量上升效果不明顯，因此，選擇60 s為最佳提取時(shí)間。

2.5 最佳提取工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溶劑添加量（15、20、25 mL）、三氯甲烷與二氯甲烷混合比例（1∶1、1∶2、2∶1）、提取時(shí)間（20、40、60 s）三個(gè)因素，根據(jù)蠟質(zhì)提取量的大小，選取三個(gè)水平建立L9（33）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of orthogonal test by L9（33）

由表1可知，時(shí)間對(duì)提取量的影響最大，其次是溶劑添加量，最后是混合比例。因此，最佳工藝條件為A2B2C3，即溶劑添加量為20 mL，三氯甲烷與二氯甲烷的比為 1∶2，提取時(shí)間為 60 s。

2.6 GC-MS分析結(jié)果

在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將所提取蠟質(zhì)物質(zhì)通過處理后按照上述氣質(zhì)聯(lián)用方法和條件進(jìn)行GC-MS分析，其結(jié)果見圖4和表3所示。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of experimental results

圖4 灰棗表皮蠟質(zhì)成分的總離子流圖Fig.4 The better condition of extraction from jujube epicuticular wax components of the total ion chromatogram

表3 灰棗表皮蠟質(zhì)成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 3 Compositions of Jujube epicuticular wax by GC-MS

續(xù)表3 灰棗表皮蠟質(zhì)成分的GC-MS分析結(jié)果Continue table 3 Compositions of Jujube epicuticular wax by GC-MS

由圖4和表3可知，GC-MS共檢測(cè)到29個(gè)峰，經(jīng)檢索Nist05譜庫(kù)和人工解析譜圖相結(jié)合，鑒定出24種化合物，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的76.17%，其中匹配度較高的組分有6-烯丙基-4甲氧基苯并1，3-二氧環(huán)戊烯（37.23%）、十六碳酸（9.56%）、9反-十八碳烯酸（6.82%）、5-亞異丙基-1，3環(huán)戊二烯（1.34%）、己酸（1.73%）、甘油（3.98%）、壬酸（1.26%）、9反，12反-9，12十八二碳烯酰氯（0.90%）、10反-十五烯醇（2.23%）、9順，12順十八碳二烯酸1-甘油酯（0.93%）。

3 結(jié)論

本文通過單因素和正交試驗(yàn)研究了紅棗果皮蠟質(zhì)提取條件，考察了提取溶劑、溶劑添加量、溶劑混合比和提取時(shí)間對(duì)提取灰棗果皮蠟質(zhì)成分的影響，實(shí)驗(yàn)表明，以三氯甲烷和二氯甲烷為提取溶劑，溶劑添加量為20 mL，三氯甲烷與二氯甲烷混合比為1∶2），提取時(shí)間為60 s時(shí)其提取效率最好。對(duì)所得蠟質(zhì)經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用分析共鑒定出24種化合物，其中酯類5種，酸類7種，醇4類種，烯類3種，烷類2種，三氟乙酰胺、9反，12反-9，12十八二碳烯酰氯各一種。

[1] 閆忠心,魯周民,劉坤,等.我國(guó)紅棗資源加工利用研究現(xiàn)狀與展望[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,38（6）：102-108

[2] 郭福則.紅棗加工產(chǎn)品的加工工藝[J].科研推廣農(nóng)產(chǎn)品加工,2004,24（6）：30-31

[3] GREENE P R,BAIN C D.Total internal reflection Raman spectroscopy of barley le-af epicuticular waxes in vivo[J].Colloids surfaces B,2005,45：174-180

[4] Fei Wang A B C,Peng Zhang D,Sheng Qiang A E,et al.Effects of epicuticular wax from Digitaria sanguinalis and Festuca arundinacea on infection by Curvularia eragrostidis J[J].Austra Lasian plant pathology,2008,37:43-52

[5] 王美芳,陳巨蓮,程髓發(fā),等.小麥葉片表面蠟質(zhì)及其與品種抗蚜性的關(guān)系[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2008,14(3):34-346

[6] Shu-Jun Xu,Ping-An Jiang,Zheng-Wu Wang,et al.Crystal structures and chemical composition of leaf surface wax epositions on the desert moss Syntrichia caninervis[J].Biochemical systematics and ecology,2009,37:723-730

[7] 周小云,陳倌波,徐向麗,等.稻葉表皮蠟質(zhì)提取方法及含量的比較[J].湖南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,33（3）：273-276

[8] 鄭喜清,胡俊,胡寧寶,等.不同哈密瓜品種對(duì)細(xì)菌性果斑病的抗性與蠟質(zhì)的關(guān)系[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28（2）：132-134