鄭宏

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100007）

血塞通注射液對缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細胞線粒體損傷的影響*

鄭宏

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100007）

目的觀察血塞通注射液對缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細胞線粒體損傷的影響。方法 采用MTT比色法（四唑鹽比色實驗）測定線粒體活性，流式細胞儀測定凋亡細胞百分率，觀察不同劑量血塞通注射液（血塞通0.0781 μL、0.0391 μL、0.0195 μL）對神經(jīng)細胞線粒體損傷的影響。結(jié)果神經(jīng)細胞缺氧缺糖4 h再給氧12 h、24 h細胞線粒體活性明顯降低，神經(jīng)細胞凋亡率明顯增加。血塞通注射液0.0781 μL、0.0391 μL組與模型組比較在線粒體活性12 h OD值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），0.0391 μL組測定24 h OD值仍有明顯差異（P＜0.05）。血塞通0.0781 μL、0.0391 μL組12 h的神經(jīng)細胞凋亡率與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；0.0391 μL、0.0195 μL組24 h的神經(jīng)細胞凋亡率與模型組差異明顯（P＜0.01）。結(jié)論不同劑量血塞通注射液能夠明顯提高神經(jīng)細胞線粒體活性，并且不同程度抑制經(jīng)細胞凋亡率的增加。

血塞通注射液 神經(jīng)細胞凋亡 線粒體損傷

缺血性腦血管的病理損害主要包括缺血性和缺血/再灌注性損害，兩者可導致神經(jīng)細胞的死亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷是缺血性腦細胞損傷過程中的重要環(huán)節(jié)［1］。線粒體又是細胞核外唯一含DNA的細胞器，凋亡是由線粒體DNA和核DNA相互作用、雙重調(diào)控的病理生理過程［2］。因此線粒體是缺血再灌注腦損傷的重要靶目標［3］。本實驗選用SH-SY5Y神經(jīng)細胞，采用缺氧缺糖/再灌注的方法，模擬人體缺血再灌注損傷，觀察中藥血塞通注射液（三七提取物三七總皂苷）對缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細胞線粒體活性損傷、神經(jīng)細胞凋亡率的影響，探討其作用環(huán)節(jié)及機制。

1 材料與方法

1．1 實驗器材 培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，血清為Hyclone公司產(chǎn)品，碘化丙啶和MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品，尼莫地平為山東新華制藥有限公司產(chǎn)品，血塞通注射液為黑龍江珍寶島制藥有限公司產(chǎn)品。5％CO2培養(yǎng)箱：德國HERAEUS-BB16型。超凈工作臺：北京半導體設備儀器廠JJT1300型。倒置相差顯微鏡：日本OLYMPUS IMT-2型。低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠生產(chǎn)LD4-2型。移液器：芬蘭Labsystems Finnpipette系列。流式細胞儀：美國BD公司FACS Calibur型。

1．2 種板 SH-SY5Y神經(jīng)細胞用含100％胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。鏡下觀察細胞約90％匯合時，用消化液消化細胞，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，96孔板每孔100 μL細胞懸液，T25培養(yǎng)瓶每瓶5 mL細胞懸液，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 缺氧缺糖/再復氧模型分組及給藥方法 每種藥物濃度根據(jù)MTT藥物毒性實驗結(jié)果進行選擇。各藥物組棄去原培養(yǎng)液，用無糖Earle’s液洗細胞2次，96孔板內(nèi)換入的藥物終濃度分別為每100 μL無糖Earle’s含尼莫地平2.5 μL、1.25 μL、0.625 μL，血塞通0.0781 μL、0.0391 μL、0.0195 μL；T25培養(yǎng)瓶內(nèi)藥物濃度分別為每100μL無糖Earle’s含尼莫地平12.5μL，血塞通0.781μL、0.391μL、0.195μL；正常組換成無糖Earle’s液。于37℃缺氧箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)4 h，后換入無血清DMEM培養(yǎng)基在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12 h、24 h復氧。正常組在模型組及各藥物組缺氧時進行正常培養(yǎng)，后與模型組和各藥物組一起換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h、24h。

1.4 線粒體活性的測定 采用MTT比色法測定線粒體活性。96孔板中的各組細胞經(jīng)缺氧/缺糖再給氧和藥物處理后，吸棄各孔培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基100 μL，再加入20 μL MTT，混勻，37℃溫育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min，充分溶解有活性的細胞中生成的藍色顆粒。用酶標儀在550 nm波長處測定OD值，酶標儀自動打印結(jié)果。根據(jù)結(jié)果進行細胞線粒體活力的測定。

1.5 凋亡細胞計數(shù) 經(jīng)消化液消化收集細胞懸液后，1000×g離心5 min，棄上清液，用PBS洗1次，用70％乙醇4℃冰箱內(nèi)固定12 h以上。取固定后的細胞用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗2遍并懸浮，后加入終質(zhì)量濃度為20 mg/L的RNaseA，37℃恒浴1 h，再加入PI染液至終質(zhì)量濃度50 mg/L，搖勻后4℃避光靜置1 h，在FACS Calibur型流式細胞儀上計數(shù)1萬個細胞，測定凋亡細胞所占比例。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 各組線粒體活性比較 見表1。與正常組相比，模型組神經(jīng)細胞缺氧缺糖4 h再給氧12 h、24 h細胞線粒體活性降低（P＜0.05或P＜0.01），提示缺氧缺糖/再給氧損傷可明顯造成神經(jīng)細胞線粒體的損傷；血塞通注射液能夠明顯提高神經(jīng)細胞線粒體活性。

2．2 各組缺氧缺糖/再灌注損傷神經(jīng)細胞凋亡率比較見表2。神經(jīng)細胞經(jīng)過缺氧缺糖4 h再給氧12 h、24 h后神經(jīng)細胞凋亡率明顯增加，尼莫地平1.25 μL組和血塞通各劑量組能夠不同程度抑制經(jīng)細胞凋亡率的增加，與模型組相比有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3 結(jié)論

近年來，中醫(yī)藥在治療缺血性腦損傷顯示了良好的前景，已引起國內(nèi)外醫(yī)學的重視，但從線粒體入手的研究還不多。線粒體是產(chǎn)生和儲存ATP的場所，在缺血缺氧條件下，一方面，線粒體酶活性的改變影響到線粒體的呼吸功能［4］，使線粒體不能有效合成ATP；另一方面，線粒體從胞漿攝取過量的Ca2+，導致線粒體Ca2+升高［5］，使氧化磷酸化效率降低，ATP合成減少。因此，線粒體損傷導致的能量代謝障礙是缺血性腦細胞損傷過程中的重要環(huán)節(jié)。線粒體作為細胞核外唯一含DNA的細胞器，還對細胞凋亡起著中心調(diào)控作用，細胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)都與線粒體密切相關(guān)，如線粒體膜電位的喪失［6］，導致氧化磷酸化脫偶聯(lián)，氧自由基生成增多而細胞凋亡；線粒體內(nèi)重要的細胞凋亡蛋白細胞色素C的釋放［7］，使Caspase家族活化，激活脫氧核糖核酸酶，水解核酸及細胞骨架蛋白，最終引起細胞凋亡。

表1 各組缺氧缺糖4 h復氧12 h、24 h線粒體OD值比較（±s）

表1 各組缺氧缺糖4 h復氧12 h、24 h線粒體OD值比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 12 h正常組 0.194±0.015**模型組 0.140±0.016尼莫地平2.5 μL組 0.147±0.008 24 h 0.190±0.019*0.167±0.011 0.143±0.020尼莫地平1.25 μL組 0.165±0.010** 0.176±0.019尼莫地平0.625 μL組 0.169±0.005** 0.181±0.008*血塞通0.0781 μL組 0.171±0.020** 0.161±0.012血塞通0.0391 μL組 0.194±0.021** 0.199±0.010**血塞通0.0195 μL組 0.146±0.011 0.142±0.009

表2 各組神經(jīng)細胞缺氧缺糖4 h復氧1 2 h、2 4 h神經(jīng)細胞凋亡率（％，x±s）

表2 各組神經(jīng)細胞缺氧缺糖4 h復氧1 2 h、2 4 h神經(jīng)細胞凋亡率（％，x±s）

組 別 12 h正常組 3.40±0.80**模型組 15.01±0.64 24 h 3.40±0.80**17.44±0.81尼莫地平1.25 μL組 8.04±0.48* 7.89±0.50*血塞通0.0781 μL組 5.59±1.19** 7.44±1.07*血塞通0.0391 μL組 5.89±0.72** 5.12±0.28**血塞通0.0195 μL組 7.19±0.46* 5.27±0.48**

血塞通注射液主要成分為三七總皂苷，臨床具有保護心肌、抗心率失常、抗休克、降低動脈血壓、抑制血小板聚集、增加心腦血流量等多方面的作用。實驗研究表明三七總皂苷能降低細胞LDH的釋放，降低細胞內(nèi)Ca2+水平，使細胞凋亡及壞死神經(jīng)元百分率明顯降低，對缺血再灌注損傷的神經(jīng)元有保護作用［8］。本實驗選用SH-SY5Y神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)，采用缺氧缺糖/再灌注的方法，模擬人體缺血再灌注損傷，觀察不同劑量血塞通注射液對缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細胞線粒體活性損傷的影響。實驗結(jié)果提示，血塞通注射液能夠不同程度地提高神經(jīng)細胞線粒體活性，并且不同程度抑制經(jīng)細胞凋亡率的增加。

［1］Abe T，Takagi N，Nakano M，et al.The effects of monobromobimane on calcium and phenylarsineoxide-induced mitochondrial swelling and cytochrome C release in isolated brain mitochondria［J］.Biol Pharm Bull.2004，27（4）：524-527.

［2］Zou H，Li Y，Liu X，et al.An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9［J］.J Biol Chem，1999，274（17）：11549-11556.

［3］李露斯，汪青松，蔡昌啟．缺血再灌注對腦線粒體磷脂、游離脂肪酸和呼吸的影響［J］．中風與神經(jīng)疾病雜志，1997，14（1）：2-4.

［4］熊杰，馮亦璞．丁基苯酞對線粒體呼吸鏈復合酶活性的影響［J］．藥學學報，1999，34（4）：241-245.

［5］Cano-Abad MF，Villarroya M，Garcia AG，et al.Calcium entry through L-type calcium channels causes mitochondrial disruption and chromaffin cell death［J］.J Biol Chem，2001，276（43）：39695-39704.

［6］管增偉，王盛蘭，李勇，等.凋亡細胞膜和線粒體的動態(tài)變化［J］.衛(wèi)生研究，2000，29（2）：83-86.

［7］Domanska-Janik K，Buzanska L.Neuroprotection by cyclosporin A following transient brain ischemia correlates with the inhibition of the early efflux of cytochrome C to cytoplasm［J］.Brain Res Mol Brain Res，2004，121（1-2）：50-59.

［8］朱陵群，范吉平，黃啟福，等．三七總皂苷抗缺氧缺糖再給氧誘導大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的研究［J］．中國中藥雜志，2003，28（1）：52-54.

Influences of Xuesaitong Injection on Hypoxia/hypoglycem ia and Neuronal M itochondria Damage w ith SH-SY5Y Reperfusion

ZHENG Hong.Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

Objective：To observe the influences of Xuesaitong Injection on hypoxia/hypoglycemia and neuronal mitochondria apoptosis with SH-SY5Y-reperfusion.M ethods：Mitochondrion activity was detected by methyl thiazolyltetrazolium test（MTT）.The apoptosis percentage was detected by flow cytometry to observe different influenceson neuronal mitochondria damage based on different density of Xuesaitong Injection used（0.0781 μL，0.0391 μL and 0.0195 μL）.Results：After hypoxia-hypoglycemia treating for 4 hours and reoxygenation treating for 12 and 24hours，the neuron mitochondrion activity was decreased significantly.On the other hand，the apoptosis rate of neurons had distinct increase.Conclusion：Xuesaitong Injection with various density could enhance neuronal mitochondria activity significantly and inhibit the increase of neuron apoptosis percentage accordingly.

Xuesaitong Injection；Neuron apoptosis；Mitochondrial damage

R285.5

A

1004-745X（2014）03-0437-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.03.024

2013-12-09）

北京中醫(yī)藥大學校級課題（2005X72）