李景源 吳劉成 鄭波 邵義祥

作者單位：226001 南通 江蘇南通大學比較醫(yī)學研究所

基礎研究

雷公藤紅素對裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

李景源 吳劉成 鄭波 邵義祥

作者單位：226001 南通 江蘇南通大學比較醫(yī)學研究所

目的 研究天然活性化合物雷公藤紅素（celastrol）對裸鼠移植腫瘤的抑制作用。方法建立人源肝癌HepG2細胞的裸鼠皮下移植腫瘤模型。20只裸鼠隨機分為4組，即空白對照組和雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組分別按4.0 mg/kg、2.0 mg/kg、1.0 mg/kg雷公藤紅素腹腔給藥，每日一次，每周5 d，共給藥30 d，實驗中每5 d測量一次腫瘤體積的變化。結(jié)果 雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組的體積抑瘤率分別是89.52%、65.60%和12.21%，與空白對照組相比，高劑量組、中劑量組的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高劑量雷公藤紅素給藥后對裸鼠肝臟和腎臟等產(chǎn)生嚴重的毒性反應。結(jié)論 雷公藤紅素對裸鼠肝癌皮下移植瘤具有良好的體內(nèi)抗腫瘤效果，應進一步開展藥物新劑型及分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面的研究，減少其毒副反應。

肝腫瘤；雷公藤紅素；肝癌皮下移植瘤模型；抑制；毒性

雷公藤紅素（celastrol），別名南蛇藤素，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤tripterygium wilfordii Hook.f.的根、葉及花中提取的、具有多種生物活性的活性單體之一，屬醌甲基三萜類色素，因其具有確切的抗炎、免疫抑制及抗癌作用而受到越來越廣泛關(guān)注［1，2］。中美科學家合作研究表明，雷公藤紅素作為一種蛋白酶體抑制劑具有出色的抗腫瘤效果，抑瘤率高達65%～93%，遠高于目前國際市場上暢銷的紫杉醇注射液［3］。研究表明，誘導腫瘤細胞凋亡可能是雷公藤紅素抗腫瘤作用的主要機制。我們的前期體外實驗研究也表明，雷公藤紅素具有顯著的抗腫瘤活性，對白血病（K562）細胞、肺癌（A549）細胞以及肝癌（HepG2）細胞等多種腫瘤細胞均有抑制作用［4，5］。為了進一步研究雷公藤紅素在體內(nèi)的抗腫瘤活性，本研究將人源肝癌HepG2細胞移植于裸鼠皮下，建立裸鼠肝癌皮下移植腫瘤動物模型，探討雷公藤紅素的體內(nèi)抗腫瘤活性，以及對部分正常器官、組織的毒副反應。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO，USA）；小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；胰蛋白酶（Amresco，USA）；雙抗（Amresco，USA）；雷公藤紅素（廣州牌牌生物科技有限公司）；蘇木素染色液和伊紅染色液（海門市碧云天生物技術(shù)研究所）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

選用BALB/c-nu裸小鼠，雌性，體重為22~24 g，鼠齡5~7周，SPF級，共30只。由南通大學實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2008-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0031。飼料、飲水和籠具等均經(jīng)高壓滅菌和紫外線消毒后使用。飼養(yǎng)級別為SPF級屏障環(huán)境。

1.3 HepG2肝癌細胞的體外培養(yǎng)

HepG2肝癌細胞購自中國科學院上海細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.4 BALB/c-nu裸小鼠腫瘤動物模型的建立

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，去上清液，離心洗滌2次，細胞計數(shù)并配制約為3×107/ml的細胞懸液。取上述細胞懸液0.3 ml，用1 ml注射器將細胞接種到裸小鼠右腋下皮下組織。接種后正常飼養(yǎng)，觀察裸鼠的生長情況，待皮下生長出可觸及的、直徑為3 mm左右的瘤塊時，剔除瘤塊直徑最大和最小的裸鼠，建立裸鼠皮下移植瘤模型。

1.5 實驗動物分組及給藥

采用隨機分組的方法，將經(jīng)過篩選的20只荷瘤裸小鼠分成4組，每組5只。即空白對照組；高劑量組，雷公藤紅素4.0 mg/kg；中劑量組，雷公藤紅素2.0 mg/kg；低劑量組，雷公藤紅素1.0 mg/kg。分組后開始給藥，雷公藤紅素用DMSO助溶后再以PBS稀釋至所需濃度，采用腹腔內(nèi)注射給藥方法分組給藥，每日一次，每周5 d，共給藥30 d。給藥后裸鼠正常飼養(yǎng)。

1.6 荷瘤裸鼠生長情況的觀察和測量腫瘤大小

定期觀察荷瘤裸鼠精神、飲食和排便狀況。以開始投藥前所測腫瘤體積為基準，每隔5 d測量荷瘤裸鼠體重，并用游標卡尺測量腫瘤的最長徑和最短徑，共6次。腫瘤體積的計算公式：V=長徑×短徑×短徑/2，計算其平均值并繪制腫瘤體積生長和體重變化圖。

1.7 腫瘤標本的組織學處理

將荷瘤裸鼠于給藥后第31天脫臼處死。觀察移植瘤的形態(tài)，并取出腫瘤，稱重，置于4%多聚甲醛中固定，逐級脫水后，制成4 μm石蠟切片，經(jīng)過HE染色后中性樹脂封片，晾干后于倒置顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行處理。計量資料用（±s）表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用具有重復測量的兩因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤裸鼠及腫瘤的生長狀況

在給藥之前，荷瘤裸鼠的體重隨時間呈緩慢增加的趨勢，腫瘤體積也逐漸增大，生長速率略有差別。腫瘤形態(tài)呈球形或不規(guī)則團塊狀，邊界較清楚，有活動性，有部分輕微浸潤皮膚，說明裸鼠的皮下移植腫瘤模型建模成功。給藥初期，荷瘤裸鼠活動正常。給藥10 d后，中劑量組和高劑量組的藥物開始對荷瘤裸鼠產(chǎn)生一定的毒副反應，體重減輕。至實驗接近結(jié)束時，中劑量組和高劑量組藥物的毒副反應明顯，荷瘤裸鼠的行動遲緩、厭食，體重明顯減輕。

2.2 腫瘤體積的生長變化與比較

在對荷瘤裸鼠給藥后，每隔5 d用游標卡尺記錄各組荷瘤裸鼠腫瘤的體積。實驗結(jié)束時，雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組的體積抑瘤率分別是89.52%、65.60%和12.21%。如圖1所示，隨著雷公藤紅素劑量的增加，對腫瘤的生長抑制率也隨之變大，存在劑量依賴性關(guān)系。采用具有重復測量的兩因素方差分析對多組樣本均數(shù)進行比較，F(xiàn)=5.90，P=0.0055，差異具有統(tǒng)計學意義，顯示空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4個組中的腫瘤體積的總體均數(shù)不全相同；進一步用最小顯著差法（LSD-t）對組間兩兩進行比較，結(jié)果顯示與空白對照組相比，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義，而中劑量組和高劑量組的差異均具有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。見表1。

2.3 荷瘤裸鼠體重的變化情況及比較

實驗初期，各組荷瘤裸鼠生長狀況良好。如圖2所示，對于空白組和低劑量組的荷瘤裸鼠，實驗過程中未觀察到明顯的毒副反應。而對于高劑量組藥物干預的荷瘤裸鼠，在實驗的后期，荷瘤裸鼠的體重明顯減輕。采用具有重復測量的兩因素方差分析對多組樣本均數(shù)進行比較，F(xiàn)=5.71，P=0.0063，差異具有統(tǒng)計學意義。表示空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4個組中的荷瘤裸鼠體重的總體均數(shù)不全相同；進一步用最小顯著差法（LSD-t）對組間進行兩兩比較，結(jié)果顯示：與空白對照組荷瘤裸鼠相比，高劑量組荷瘤裸鼠體重的變化具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而中劑量組和低劑量組荷瘤裸鼠體重的變化均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。提示高濃度雷公藤紅素對荷瘤裸鼠的正常生長有較大影響，具有較大的毒副反應。

圖1 不同實驗組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化情況

圖2 不同實驗組荷瘤裸鼠體重變化情況

表1 不同實驗組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化的比較（±s，mm3）

表1 不同實驗組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化的比較（±s，mm3）

分別與空白對照組比較，△P＞0.05;*P＜0.05。

組別 給藥前 第5天 第10天 第15天 第20天 第25天 第30天 F P空白對照組 16.49±18.07 56.51±20.04 133.12±32.66 224.18±32.41 332.50±45.50 523.40±14.06 836.74±40.05 - -低劑量組 15.23±21.26 48.23±13.77 78.63±25.35 113.34±12.13 194.40±38.71 440.90±57.02 734.53±62.04 1.06 0.318△中劑量組 14.75±20.42 28.13±19.01 52.59±24.12 76.08±33.23 100.72±23.58 164.67±45.58 287.85±43.64 8.34 0.010*高劑量組 13.94±15.36 19.43±10.17 24.06±11.63 32.01±20.05 50.66±16.18 69.00±20.85 87.67±26.37 3.77 ＜0.001*

表2 不同實驗組荷瘤裸鼠體重變化的比較（±s，g）

表2 不同實驗組荷瘤裸鼠體重變化的比較（±s，g）

分別與空白對照組比較，△P＞0.05；*P＜0.05。

組別 給藥前 第5天 第10天 第15天 第20天 第25天 第30天 F P空白對照組 23.00±0.28 23.40±0.56 23.45±1.06 24.05±1.06 23.80±0.42 24.10±1.35 24.45±0.49 - -低劑量組 22.00±0.56 22.45±0.21 22.30±0.28 22.10±0.98 22.65±0.63 22.26±0.73 22.65±0.63 3.98 0.065△中劑量組 23.70±0.56 23.65±0.21 23.35±0.35 22.75±0.07 22.50±0.84 21.50±0.98 19.50±0.56 3.55 0.076△高劑量組 23.80±0.42 23.25±0.35 22.05±0.63 20.50±0.82 19.90±0.70 18.50±0.84 16.75±0.63 4.13 ＜0.001*

2.4 4組荷瘤裸鼠腫瘤的重量比較

實驗結(jié)束后，將4組荷瘤裸鼠取出腫瘤組織，剔除結(jié)締組織后稱重。對4組荷瘤裸鼠腫瘤重量進行比較，顯示空白對照組荷瘤裸鼠腫瘤最重［（245.95±20.09）mg］，而雷公藤紅素高劑量組的腫瘤重量最輕［（30.50±13.38）mg］。根據(jù)腫瘤重量計算抑瘤率，高劑量組為87.60%；中劑量組為64.87%，低劑量組為22.77%，與空白對照組的腫瘤重量比較，中劑量組和高劑量組的差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），這與上述3個劑量組體積抑瘤率的結(jié)果基本一致。顯示腫瘤重量的降低與雷公藤紅素的給藥濃度呈明顯的劑量依賴性。

2.5 荷瘤裸鼠腫瘤組織及肝腎組織HE染色檢查結(jié)果

2.5.1 腫瘤組織 實驗結(jié)束后，取出荷瘤裸鼠腫瘤組織并經(jīng)石蠟切片后用HE染色。如圖3所示，空白對照組腫瘤組織完整，雷公藤紅素低劑量組、中劑量組、高劑量組的腫瘤組織的損壞程度呈增強趨勢。特別是中劑量組和高劑量組，腫瘤組織壞死現(xiàn)象嚴重，出現(xiàn)大片狀壞死，腫瘤細胞凋亡較多?？梢娎坠偌t素對腫瘤組織產(chǎn)生一定的細胞毒性，且其對腫瘤組織的破壞程度隨給藥劑量的增加而增強。

2.5.2 肝、腎組織 本實驗重點考察了雷公藤紅素對荷瘤裸鼠肝臟和腎臟產(chǎn)生的影響。如圖4和圖5所示，通過觀察比較可以看出，空白對照組和低劑量組荷瘤裸鼠的肝、腎組織的細胞基本沒有損傷，而中劑量組和高劑量組荷瘤裸鼠的肝、腎組織受到一定程度損壞，特別是高劑量組的腎組織出現(xiàn)細胞損壞的程度較大。由此可見，隨著雷公藤紅素用藥劑量的增加，雷公藤紅素對荷瘤裸鼠的肝臟和腎臟產(chǎn)生較嚴重的毒副反應，對組織器官產(chǎn)生一定的損害。

3 討論

源于傳統(tǒng)中藥的天然活性化合物在癌癥的治療以及新藥研發(fā)中發(fā)揮著越來越重要的作用。雷公藤紅素是我國首先從雷公藤根中提煉出來的三萜類活性單體，是雷公藤提取物的主要活性成分之一。雷公藤紅素具有顯著的抗癌活性，在治療人類癌癥方面具有巨大的潛力和應用前景［6，7］。雷公藤紅素是熱休克蛋白Hsp90信號通路的調(diào)節(jié)劑［8，9］，且能夠使SHG-44細胞bax的表達增加，bcl-2的表達下降，促進腫瘤細胞凋亡［10］。另外，雷公藤紅素能夠促使人急性髓系白血病HL-60細胞中NF-κB基因表達的下調(diào)，并且可上調(diào)Fas、FasL基因的表達［11］。雷公藤紅素能夠經(jīng)由caspase依賴和caspase非依賴兩種途徑來誘導人乳腺癌MCF-7細胞的凋亡，誘導細胞色素c、AIF等線粒體凋亡蛋白從線粒體釋放到細胞質(zhì)基質(zhì)［12］。在原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC和人前列腺癌PC-3細胞［13］、SHG44膠質(zhì)瘤細胞［14］等細胞中，雷公藤紅素可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），從而抑制VEGF誘導的細胞增殖、遷移和入侵等過程。

圖3 荷瘤裸鼠腫瘤組織HE染色檢查的結(jié)果（HE×200）

圖4 荷瘤裸鼠肝組織HE染色檢查的結(jié)果（HE×400）

圖5 荷瘤裸鼠腎組織HE染色檢查的結(jié)果（HE×400）

目前關(guān)于雷公藤紅素的體內(nèi)抗腫瘤活性以及組織毒性等評價試驗相對較少。有報道稱，雷公藤紅素在SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠的抑瘤試驗中，雷公藤紅素4 mg/kg組和2 mg/kg組的體積抑瘤率分別為35.0%、26.9%［15］。另外，植入人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠體內(nèi)試驗結(jié)果表明，雷公藤紅素可以抑制VEGF受體1和VEGF受體2的表達和轉(zhuǎn)錄，這可以說明阻斷VEGF受體的表達是雷公藤紅素抑制腫瘤細胞生長的主要機制［16］。有報道表明，在人源肺癌（95-D）細胞建立的裸鼠模型實驗中，將雷公藤紅素與伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）聯(lián)合應用能夠顯著抑制腫瘤的生長，當單獨注射雷公藤紅素（0.5 mg/kg）或SAHA（100 mg/kg）時，抗腫瘤效果不明顯，當聯(lián)合注射兩種藥物時，其體積抑瘤率達到70.3%，并且小鼠體重未減輕，毒性較小［17］。

本實驗中，我們將HepG2肝癌細胞接種于裸鼠皮下，建立皮下移植肝癌動物模型，研究了雷公藤紅素在體內(nèi)的抗腫瘤活性，并初步探討了雷公藤紅素對部分組織器官的毒性作用。通過實驗數(shù)據(jù)分析，雷公藤紅素對腫瘤組織具有明顯的生長抑制作用，且存在劑量效應的依賴性。雷公藤紅素高劑量組、中劑量組和低劑量組的體積抑瘤率分別是89.52%、65.60%和12.21%，與空白對照組相比，高劑量組、中劑量組均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。同時，通過對荷瘤裸鼠部分組織器官的組織學觀察，顯示雷公藤紅素對荷瘤裸鼠肝臟和腎臟等組織器官存在一定的毒副反應，特別是在中劑量、高劑量給藥時毒副反應更為明顯，這將限制其在臨床治療的實際應用，因此如何降低其對正常組織細胞的毒副反應，仍需進一步研究。深入探討對化合物結(jié)構(gòu)的改造及新劑型的研發(fā)等將是今后研究工作的重要方向。

4 小結(jié)

本實驗通過裸鼠皮下移植腫瘤模型的體內(nèi)試驗，表明雷公藤紅素對HepG2細胞的皮下移植腫瘤具有明顯的生長抑制作用，并呈劑量依賴性。同時，高劑量給藥時，雷公藤紅素對荷瘤裸鼠肝臟和腎臟等正常器官組織有一定的毒副反應。深入分析藥物的抗腫瘤效果和對正常組織的毒性作用，將為雷公藤紅素的藥效學研究提供可靠的實驗依據(jù)。

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［2014-07-29收稿］［2014-08-20修回］［編輯 阮萃才］

Celastrol-mediated growth inhibition of subcutaneously transplanted hepatocarcinoma in nude mice

LI Jing-yuan，WU Liu-cheng，ZHENG Bo，SHAO Yi-xiang（Institute of Comparative Medicine，Nantong University，Nantong 226001，P.R.China）

SHAO Yi-xiang.E-mail：shaoyx@ntu.edu.cn

Objective To study the potential of celastrol to inhibit growth of transplanted tumors in nude mice.Methods Nude mice（n=20）subcutaneously injected with HepG2 cells were randomly divided into 4 groups and treated by abdominal injection with 0，1.0，2.0 and 4.0 mg/kg once daily five times per week.Tumor size was measured every five days.Results Tumor volume inhibition was 12.21%for 1.0 mg/kg，65.60%for 2.0 mg/kg and 89.52%for 4.0 mg/kg，and tumor volume was significantly smaller in animals treated with 2.0 or 4.0 mg/kg than in control animals.Severe liver and kidney toxicity were observed in animals treated with 4.0 mg/kg. Conclusion Celastrol shows good anticancer activity in this mouse model of liver cancer.Studies are needed to optimize dosing and drug structure to reduce toxicity.

Liver neoplasm；Celastrol；Liver cancer model；Inhibition；Toxicity

R735.7

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.03

江蘇省高校自然科學研究面上項目（13KJB310015）；南通市科技計劃項目（BK2013045）；南通大學引進人才科研啟動基金資助項目（13R30）；南通大學自然科學科研基金助項目（13ZY008）

邵義祥。E-mail：shaoyx@ntu.edu.cn