黃新飛凌永赤齊魯楠?dú)W超

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；543200 扶綏△廣西扶綏縣人民醫(yī)院普通外科；2廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部

基礎(chǔ)研究

廣西扶綏地區(qū)黃曲霉毒素B1相關(guān)性肝細(xì)胞癌蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析

黃新飛△凌永赤△齊魯楠1歐超2

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；543200 扶綏△廣西扶綏縣人民醫(yī)院普通外科；2廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部

目的 研究廣西扶綏地區(qū)黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）相關(guān)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，篩選與AFB1暴露相關(guān)的肝癌分子標(biāo)志物，并初步探討AFB1的致肝癌機(jī)制。方法 40例HCC組織按照AFB1的暴露情況分為兩個(gè)亞組：A組為AFB1暴露組（24例），B組為非AFB1暴露組（16例），同時(shí)收集10例來自肝血管瘤、肝外傷、肝移植供體等手術(shù)切除的正常肝組織作為正常對照。應(yīng)用iTRAQ結(jié)合2DLC-MS/MS技術(shù)分析蛋白質(zhì)表達(dá)譜在各組間的差異。結(jié)果 按照組間差異參數(shù)ratio>2.0（上調(diào)）或ratio<0.5（下調(diào)）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，兩個(gè)亞組共鑒定出差異蛋白88種（上調(diào)的蛋白51種，下調(diào)的蛋白37種），其中50種差異蛋白在兩個(gè)亞組中均有相同變化趨勢，其余38種差異蛋白則存在AFB1暴露的病因?qū)W特異性。通過GO注釋對篩選出的差異蛋白進(jìn)行分類分析，88種差異蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及線粒體，以結(jié)合功能和催化功能相關(guān)蛋白為主，主要參與毒物代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)及抗凋亡等生物學(xué)過程。結(jié)論 本研究篩選出多種與AFB1暴露相關(guān)性HCC的差異蛋白，為探討廣西扶綏AFB1高暴露地區(qū)的HCC發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。

肝腫瘤；黃曲霉毒素B1；蛋白質(zhì)組學(xué)；iTRAQ技術(shù)

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤之一，HCC的發(fā)生與多種遺傳學(xué)因素與環(huán)境致病因素有關(guān)，并存在地域差異性。例如，在日本和歐美國家，70%以上的HCC發(fā)生與慢性丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染和酒精高攝入有關(guān)［1，2］；在我國，大約80%以上的HCC與慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的高感染率密切相關(guān)［3］。此外，以黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）為代表的環(huán)境致癌物高暴露也是我國HCC高發(fā)病率的重要因素。廣西扶綏地區(qū)是肝癌高發(fā)區(qū)，高溫、潮濕的氣候易導(dǎo)致黃曲霉菌的生長和產(chǎn)生毒素，因此環(huán)境中AFB1的高暴露成為該地區(qū)HCC高發(fā)的重要因素之一。本研究擬通過iTRAQ/2D LC-MS/MS定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析廣西扶綏地區(qū)AFB1暴露相關(guān)性HCC的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，初步篩選與AFB1暴露相關(guān)的肝癌分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究對象均為2010年9月至2013年10月收治的廣西扶綏地區(qū)肝癌患者的肝腫瘤組織，所有患者均經(jīng)病理診斷證實(shí)為HCC。我們將黃曲霉素B1暴露陽性［AFB1（+）］定義為p53-exon7-249密碼子突變陽性伴癌組織中AFB1-DNA加合物免疫組化陽性［4～7］。根據(jù)檢測結(jié)果，40例研究對象按照AFB1的暴露情況分為兩個(gè)亞組：A組為AFB1暴露組（24例），B組為非AFB1暴露組（16例）。同時(shí)收集10例來自肝血管瘤、肝外傷、肝移植供體等手術(shù)切除的正常肝組織作為蛋白質(zhì)組學(xué)正常對照組。各組樣本之間患者的性別、年齡、腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及包膜等臨床病理學(xué)因素差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療，均履行告知義務(wù)并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

iTRAQ試劑盒（八標(biāo)）購自美國Applied Biosystems公司，AFB1免疫組化6A10單克隆抗體由美國哥倫比亞大學(xué)Regina M提供，免疫組化S-P試劑盒購自上海長島生物科技公司。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司，PCR反應(yīng)體系（2×Taq PCR MasterMix）購于北京天根生化有限公司。其余試劑及儀器均由廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部提供。

1.3 AFB1-DNA加合物的免疫組化檢查

AFB1-DNA加合物染色步驟參照Regina M.Santella等的方法進(jìn)行。用已知陽性染色切片作為陽性對照。表達(dá)強(qiáng)度評估采用Fromowitz等的方法進(jìn)行，陽性結(jié)果為肝細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紫黑色點(diǎn)狀顆粒。每張切片以東南西北中高倍鏡下5個(gè)視野計(jì)數(shù)，按100%計(jì)算，染色≥5%判定為陽性。

1.4 組織細(xì)胞DNA的制備

嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）的說明書提取。采用微量核酸蛋白定量儀檢測樣品DNA的OD值（A260/A280比值）及計(jì)算濃度。并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.5 p53-exon7-249密碼子突變的檢測

各取2.0 μl的組織DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增包括外顯子的基因片段，采用GenBank提供的p53第七外顯子的引物P-333和P-313（上游引物為5′-CTTGCCACAGGTCTCCCCAA-3′，下游引物為 5′-AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA-3′）擴(kuò)增包括p53-exon7-249密碼子序列在內(nèi)的DNA片段，將產(chǎn)物交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司協(xié)助完成純化和測序。利用DNAstar軟件將樣本測得的p53第七外顯子的核苷酸序列與GenBank（gbAF136270.1 HOMOTSP1）中人類p53第七外顯子的核苷酸序列（110 bp）一一比對，如NT73～NT75位點(diǎn)上存在AGG--AGT/ AGC的突變，則認(rèn)為p53第249密碼子發(fā)生突變。

1.6 組織蛋白的提取

將凍存的肝腫瘤組織在研缽里剪碎并稱量，根據(jù)重量加入20倍體積（即1 mg肝組織加入20 μl裂解液）的裂解液0.1%SDS（w/v）、0.5 mol/L TEAB（triethylammonium bicarbonate），以及1/50裂解液體積的Complete蛋白酶抑制劑和適量的磁珠，采用多功能樣品均質(zhì)器進(jìn)行振蕩。14 000 r/min、4℃離心45 min，吸取上清液，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 iTRAQ標(biāo)記

①蛋白定量：將所有蛋白用Bradford法進(jìn)行定量，每組樣本混合700 μg（7例×100 μg），將混合后的樣品再次用Bradford法進(jìn)行定量，每組各取100 μg。②還原、封閉：每組各加2 μl TCEP還原劑，60℃孵育1 h；再加入1 μl半胱氨酸封閉試劑，室溫10 min。③酶解：向各組蛋白溶液加入5 μl胰酶（0.5 g/L）［1∶40=胰酶∶蛋白（w/w）］，37℃孵育過夜（16 h）。④標(biāo)記：將2支標(biāo)記試劑經(jīng)50 μl異丙醇稀釋后與相應(yīng)樣品混合（標(biāo)記試劑118、119分別對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組A組和B組，121對應(yīng)正常對照組），室溫放置2 h，各管中加入50 μl去離子水終止反應(yīng)，混合兩組樣品，真空離心蒸干。

1.8 強(qiáng)陽離子交換色譜（SCX）分離和質(zhì)譜分析

將標(biāo)記后的混合樣本溶于SCX緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，再通過裝有反相分離柱ZORBAX 300SB-C18 enrichment column的反相液相色譜RPLC進(jìn)行分離，洗脫出的多肽通過在線連接的QSTAR XL MS/MS質(zhì)譜儀進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，MS掃描范圍為m/z 350~1 800 u。

1.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

采用Protein Pilot Software 3.0（Applied Biosystems）軟件對肽段的MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索鑒定。鑒定的原始結(jié)果經(jīng)the Pro GroupTM Algorithm（Applied Biosystems）處理后導(dǎo)出。鑒定蛋白所采用的置信度在95%以上，即Protein Pilot軟件中Unused ProtScore≥1.3，并且至少有1個(gè)肽段與庫中的肽段95%以上匹配。組間表達(dá)差異大于50%即>2倍或<0.5倍被認(rèn)為該蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異。采用根據(jù)Gene Ontology開發(fā)的軟件Gofact工具對差異蛋白的亞細(xì)胞定位、分子功能和生物過程進(jìn)行分類。

2 結(jié)果

2.1 p53-exon7-249密碼子突變檢測結(jié)果

p53-exon7-249的突變多見于第三個(gè)核苷酸，突變形式常見為“G-T”或“G-C”兩種顛換形式（見圖1A-B）。

2.2 AFB1-DNA加合物檢測結(jié)果

顯微鏡下觀察，AFB1-DNA加合物陽性著色均定位在細(xì)胞核內(nèi)，在良好、清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu)背景下，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紫黑色點(diǎn)狀顆粒圍繞核膜分布者為AFB1-DNA加合物暴露陽性信號，肝細(xì)胞核內(nèi)未出現(xiàn)紫黑色點(diǎn)狀顆粒則為陰性信號（見圖2A-B）。

圖1 A p53基因第249密碼子突變（AGG＞AGT）

圖1 B p53基因第249密碼子突變（AGG＞AGC）

圖2 免疫組化及特殊染色法檢測HCC組織中AFB1-DNA加合物蛋白的表達(dá)（IHG×400）

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

通過iTRAQ結(jié)合2DLC-MS/MS進(jìn)行分析，以正常非瘤肝組織為對照進(jìn)行相對定量，在兩個(gè)亞組的組蛋白樣品中共同鑒定出蛋白質(zhì)367種，其中248種有定量信息。按照組間差異參數(shù)ratio>2.0（上調(diào)）或ratio<0.5（下調(diào)）為標(biāo)準(zhǔn)篩選，兩個(gè)亞組共鑒定出88種差異蛋白（包括51種表達(dá)上調(diào)的蛋白和37種表達(dá)下調(diào)的蛋白）。其中50種差異蛋白在兩個(gè)亞組中均有相同變化趨勢，其余38種差異蛋白則存在AFB1暴露的病因?qū)W特異性（見表1、表2）。

2.4 GO分類

通過GO注釋對篩選出來的差異蛋白進(jìn)行分類分析，如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鑒定出88種差異蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及線粒體（圖3-A），以結(jié)合功能和催化功能相關(guān)蛋白為主（圖3-B），主要參與了毒物 代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)及抗凋亡等生物學(xué)過程（圖3-C）。

表1 質(zhì)譜鑒定上調(diào)的差異蛋白（51種，ratio＞2.0）

（續(xù)表）

表2 質(zhì)譜鑒定下調(diào)的差異蛋白（37種，ratio＜0.5）

（續(xù)表）

圖3 差異蛋白生物學(xué)功能的GO分類

3 討論

廣西扶綏地區(qū)為我國肝癌高發(fā)區(qū)，其中以AFB1為代表的環(huán)境致癌物高暴露是導(dǎo)致該地區(qū)肝癌高發(fā)的重要因素之一。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素共同作用的結(jié)果，本研究中我們通過iTRAQ/2D LC-MS/ MS定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究廣西扶綏地區(qū)AFB1相關(guān)性HCC的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，共鑒定出88種差異表達(dá)蛋白。并采用生物信息學(xué)方法分析88種差異蛋白主要參與了毒物代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)及抗凋亡等生物學(xué)過程，提示HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多途徑參與的復(fù)雜過程，同時(shí)也表明HCC的發(fā)生是一種特異性的全身疾病，而非單純肝細(xì)胞異常增殖性疾病。鑒定出的88種差異蛋白中有50種在兩個(gè)HCC亞組中均有相同變化趨勢，提示它們可能是HCC發(fā)生、發(fā)展的共性蛋白，而其余38種則可能存在AFB1暴露的病因?qū)W特異性。

AFB1為間接致癌物，在體內(nèi)代謝活化所形成的環(huán)氧化物一部分可經(jīng)機(jī)體Ⅱ相代謝酶尤其是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GSTs）解毒。GSTs是一個(gè)多功能的超家族酶類，主要功能是催化多種致癌物的親電子類物質(zhì)與谷胱甘肽（GSH）的巰基軛合反應(yīng)，增加其疏水性以達(dá)到解毒的目的。迄今為止，人類細(xì)胞質(zhì)中的GSTs共發(fā)現(xiàn)Alpha、Mu、Pi、Theta、Zeta、Sigma和Omega 7種亞型［8］，其中GST Alpha亞型是人肝臟里主要的表達(dá)形式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中AFB1暴露組較非AFB1暴露組GSTA1和GSTO1呈下調(diào)趨勢，表明在AFB1相關(guān)性HCC中GSTs解毒酶基因的表達(dá)水平下調(diào)，從而使肝細(xì)胞對化學(xué)致癌物AFB1的解毒能力下降。然而，是什么因素導(dǎo)致了GSTs的失調(diào)？Zhou等［9］研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA陽性患者癌旁正常肝組織GST的活性明顯低于HBV-DNA陰性患者。Jaitovitch-Groisman等［10］發(fā)現(xiàn)表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞株分泌GST的能力減弱，尤其是GST Alpha亞型中的GSTA1，并且對AFB1的致癌效應(yīng)更敏感，表明在HBV與AFB1協(xié)同致癌過程中可能與HBV的表達(dá)產(chǎn)物HBx引起GST下調(diào)，從而增強(qiáng)AFB1的致癌效應(yīng)有關(guān)。結(jié)合我國大約80%以上的HCC與HBV的高感染率密切相關(guān)，提示HBV感染能促使GSTs基因表達(dá)下調(diào)或影響其蛋白活性等，通過影響化學(xué)致癌物如AFB1在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增加了AFB1的致肝癌效應(yīng)。

Peroxiredoxins（Prdxs）家族是一類廣泛存在于原核生物和真核生物中的具有過氧化氫酶活性的抗氧化蛋白。研究表明，以AFB1單獨(dú)誘發(fā)樹鼩形成的肝癌，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)第89~150周肝癌組與實(shí)驗(yàn)第45周癌前組相比，Prdx1蛋白表達(dá)上調(diào)［11］。而惟一的1-Cys Prdx就是Prdx6，它的功能與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)。在肝臟中過表達(dá)Prdx6與保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，提示其抗氧化功能主要通過還原過氧化的磷脂促進(jìn)對損傷細(xì)胞膜的修復(fù)來實(shí)現(xiàn)［12，13］。Yoo等［14］研究顯示Prdx6蛋白在Huh-7細(xì)胞的表達(dá)隨著藥物四羥黃酮濃度的增加而增加。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，Prdx1在兩個(gè)亞組中的表達(dá)均明顯上調(diào)，而Prdx6在非AFB1暴露HCC中表達(dá)下調(diào)，說明Prdx1可能抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)大量活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞存活，而Prdx6則阻礙正常肝細(xì)胞因活性氧導(dǎo)致DNA等損傷，起到腫瘤抑制作用。最近的兩個(gè)研究也報(bào)道了AFB1暴露的生物標(biāo)志物與氧化應(yīng)激的關(guān)系［3，15］。由此推測，AFB1長期暴露自身誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會促進(jìn)DNA的損傷和突變，進(jìn)而改變了AFB1的代謝過程以及生物標(biāo)志物的水平。

α烯醇酶（alpha-enolase，ENO1）作為糖酵解通路的關(guān)鍵酶，在生物界中普遍存在，其表達(dá)隨細(xì)胞病理生理、代謝、發(fā)育狀況的不同而改變［16］。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose-6-phosphate isomerase，GPI）存在于各種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也是糖酵解的重要酶類，主要功能是催化 6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖之間的轉(zhuǎn)化。Takashima等［17］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析HCV相關(guān)性HCC患者的癌組織發(fā)現(xiàn)，ENO1的表達(dá)明顯上調(diào)與腫瘤大小及靜脈侵犯呈正相關(guān)。Hamaguchi等［18］將有靜脈侵犯的HCC組與無靜脈侵犯的HCC組相比，發(fā)現(xiàn)在14種糖酵解相關(guān)基因中有8種能被低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-induible factor-1α，HIF-1α）轉(zhuǎn)錄激活而上調(diào)表達(dá)，其中就包括GPI、ENO1。有研究報(bào)道［19］，在樹鼩感染HBV的基礎(chǔ)上喂食AFB1誘發(fā)其形成肝癌，發(fā)現(xiàn)肝癌組與實(shí)驗(yàn)第45周即癌前組相比，α烯醇酶的表達(dá)上調(diào)。Matoba等［20］的近期研究顯示，抑癌基因p53突變可改變腫瘤細(xì)胞糖酵解和有氧呼吸平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPI、ENO1的表達(dá)均在AFB1暴露組中明顯上調(diào)，提示AFB1暴露下糖酵解代謝更活躍，有利于腫瘤細(xì)胞增殖，這可能與AFB1的代謝引起p53基因的第249密碼子突變有關(guān)。

AKR1B10是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NADPH依賴的可溶性單體氧化還原酶，屬于醛酮還原酶超家族中AKR1B亞家族中的一員。有研究證實(shí)煙草特異性的致癌物NNK是AKRlBl0的底物，AKR1B10在NNK相關(guān)性非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯增高［21］。在我們前期相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，HBV/AFB1雙暴露可能通過導(dǎo)致細(xì)胞染色體7q33.1畸變或通過氧化應(yīng)激致AKR1B10基因（C299S）突變等引起AKR1B10高表達(dá)參與HBV/AFB1協(xié)同致肝癌過程［22～24］。本研究結(jié)果與我們前期的研究一致，因此推測AKR1B10的過表達(dá)可能參與了AFB1的致癌過程，并有望成為潛在的、有診療價(jià)值的AFB1相關(guān)性HCC分子生物學(xué)標(biāo)志物之一。

本研究篩選出多種與AFB1暴露相關(guān)性HCC的差異蛋白，為廣西扶綏AFB1高暴露地區(qū)HCC發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的線索。但本研究僅為初步研究，且樣本量相對較少，我們將在后續(xù)的研究中擴(kuò)大樣本量對其差異蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證。

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［2014-03-20收稿］［2014-05-16修回］［編輯 游雪梅］

Proteomic analysis of aflatoxin B1-related hepatocellular carcinoma in the FuSui area of Guangxi，China

HUANG Xin-fei△，LING Yong-chi△，QI Lu-nan1，OU Chao2（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；△Department of General Surgery，The People Hospital of Guangxi FuSui，F(xiàn)uSui 543200，P.R.China；2Department of Research，Guangxi Cancer Institute，Nanning 530021，P.R.China）

QI Lu-nan.E-mail：wangzhennuo@aliyun.com

Objective To establish specific molecular marker profiles of aflatoxin B1（AFB1）-related hepatocellular carcinoma（HCC）by comparing protein expression profiles between AFB1-related and non-AFB1-related HCC in the FuSui area of Guangxi. Method A total of 24 patients with AFB1-related HCC and 16 patients with non-AFB1-related HCC group were analyzed by isobaric tagging reagent（iTRAQ）quantitative proteomics together with 2DLC-MS/MS in order to identify differences in protein expression levels. In parallel，normal liver tissue from 10 patients who were liver donors，who had hepatic hemangioma or who had undergone liver resection was analyzed as a control.Results A total of 88 unique proteins were identified that were≥2-fold overexpressed（51 proteins）or≤0.5-fold underexpressed（37 proteins）in AFB1-related HCC tissue relative to control tissue.Of the 88 proteins，50 were expressed at similar levels in AFB1-related HCC and non-AFB1-related HCC tissue，while 38 were associated with pathological features.Based on gene ontology analysis，most of the 88 proteins are predicted to play roles as binding proteins and catalysts.Most are located in the cytoplasm，nucleus or mitochondria，and most are involved in detoxification，drug metabolism and anti-apoptotic pathways.ConclusionsThis study has identified several differentially expressed proteins associated with AFB1-related HCC in the FuSui area of Guangxi，which may provide clues to understanding AFB1-related hepatocarcinogenesis in this part of the world.

Liver neoplasm；Aflatoxin B1；Roteomics；iTRAQ

R735.7

A

1674-5671（2014）03-09

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.04

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013GXNSFBA019196）

齊魯楠。E-mail：wangzhennuo@aliyun.com