車立忱

摘 要：本文根據(jù)筆者多年的PCR實驗技術(shù)應(yīng)用實踐，對其影響因素進行了詳細(xì)分析，從實驗原理、反應(yīng)體系組成與探討，反應(yīng)程序設(shè)計原則以及核酸提取等各步驟影響因素分別探討，將各操作步驟注意事項進行闡述。

關(guān)鍵詞：PCR實驗技術(shù)；影響因素；分析與探討

Abstract： According to the practical application of PCR technique to the author's many years， a detailed analysis of the influence factors， from the experimental principle， composition of the reaction system， reaction principles of program design and nucleic acid extraction， the influence factors were discussed. The operation steps precautions described.

Keywords：PCR experimental technique； influencing factors； analysis and discussion

PCR實驗技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物界諸多領(lǐng)域，在微生物病原學(xué)檢測中應(yīng)用更為普遍，此技術(shù)對病原微生物的變異、溯源，起到了關(guān)鍵性作用，但在應(yīng)用PCR進行病原分子生物學(xué)檢測時，存在著諸多影響因素，筆者通過多年的PCR實驗技術(shù)應(yīng)用，現(xiàn)將影響因素分析如下。

1 PCR實驗原理

從分子生物學(xué)相關(guān)知識了解到，雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下，加熱時會分離成兩條單鏈的DNA分子，每條單鏈DNA分子都會在DNA聚合酶的作用下，以單鏈DNA為模版，利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新的DNA互補鏈。此外，DNA聚合酶同樣需要有一小段雙鏈DNA來啟動新鏈的合成。實際上，新合成的DNA鏈的起點，是由加入在反應(yīng)混合物中的一對寡聚核苷酸引物在模板兩端的退火位點決定的。這是PCR技術(shù)的第一個特點，即能夠指導(dǎo)特定DNA序列的合成。利用合成的特定引物與分離的單鏈DNA分子結(jié)合并延伸，生成兩條新鏈，兩條新鏈進而再與引物結(jié)合再合成新鏈，循環(huán)往復(fù)，以此類推，理論上PCR產(chǎn)物會以2n的方式大量擴增。這就是PCR技術(shù)的第二個特點。最后，經(jīng)過瓊脂糖電泳對擴增產(chǎn)物進行詳細(xì)分析。

2 PCR反應(yīng)體系成分

2.1 DNA聚合酶

常規(guī)的PCR每個反應(yīng)（25～50 μL體系）大約需要0.5～2.5個單位Taq DNA，根據(jù)常規(guī)商品化制備的Taq DNA酶濃度計算，一個反應(yīng)體系中大約含2×1012～10×1012個酶分子。而Taq DNA酶進行延伸的效率一般為0.7，因此當(dāng)擴增產(chǎn)物在體系中達到1.4×1012～7×1012個分子時，酶分子幾近枯竭，成為反應(yīng)進行的一個重要的制約性因素。

2.2 引物

一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)，每條引物的典型濃度是0.1～0.5 μmol/L，這個濃度對擴增1000 bp（堿基對）DNA的片段并少于30個循環(huán)的PCR是綽綽有余的。因為濃度過高會增加引物錯配的幾率，導(dǎo)致非特異的擴增，直接影響反應(yīng)結(jié)果。

2.3 脫氧核苷三磷酸

一個PCR體系內(nèi)應(yīng)含有4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸dNTPs。如果擴增1000 bp長度的DNA片段，每種dNTPs濃度在20～200μmol/L即可，濃度過高可能會與Mg2+螯合而抑制反應(yīng)，影響擴增結(jié)果。

2.4 二價陽離子

所有DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，通常使用Mg2+。由于dNTP與寡核苷酸結(jié)合Mg2+，因而反應(yīng)體系中陽離子的濃度必須超過dNTP和引物的濃度。適當(dāng)增加鎂離子濃度可減少非特異性擴增，通常的濃度為4.5 mmol/L，但也不是絕對，應(yīng)根據(jù)不同的實驗條件、實驗要求，選擇不同的模版，并經(jīng)過反復(fù)多次試驗予以驗證。

2.5 緩沖液

一般使用商品化即可。

2.6 一價陽離子

一般包含在緩沖液內(nèi)，無需另外添加。

2.7 模版DNA

理論上，體系內(nèi)只要含有單拷貝的模版即可進行擴增反應(yīng)，所以在進行PCR反應(yīng)時模版使用量不用太多，太多的模板會影響新合成DNA產(chǎn)量。

3 PCR反應(yīng)程序設(shè)計原則

3.1 變性

雙鏈DNA的變性溫度由G+C[胞嘧呤（G）和鳥嘌呤（C）]含量決定，G+C含量越高，完全分開DNA的熔解溫度也越高。變性的時間是由DNA分子片段大小決定的，DNA分子越長，兩條鏈完全分開所需的時間也越長。對于G+C含量為55%的線性DNA模版，94～95℃變性45 s即可。

3.2 退火

退火溫度至關(guān)重要。溫度過高，引物不能很好地與模板結(jié)合，擴增效率降低；溫度過低，引物將產(chǎn)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致非特異性DNA片段的增加。一般在設(shè)計引物時，會有一個參考的退火溫度，最科學(xué)的方法是利用梯度PCR實驗技術(shù)進行試驗，用實驗結(jié)果確定最優(yōu)的退火溫度。

3.3 延伸

在最適溫度下（一般72℃），Taq DNA聚合酶的聚合速度約為2000 bp/min，根據(jù)多年經(jīng)驗一般擴增1000 bp片段，延伸時間可設(shè)計為1 min。

3.4 循環(huán)數(shù)

PCR擴增所需循環(huán)數(shù)取決于反應(yīng)體系中起始的模版拷貝數(shù)以及引物延伸和擴增效率。一旦PCR反應(yīng)進入幾何級數(shù)增長期，反應(yīng)會一直持續(xù)下去，直至某一成分成為制約因素。擴增產(chǎn)物中絕大多數(shù)應(yīng)該是特異性的擴增產(chǎn)物，而非特異性的擴增產(chǎn)物應(yīng)該是降低到難以檢測出來的程度。

4 核酸提取

核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。在分離核酸時應(yīng)遵循以下原則：保證核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除其它分子污染。

核酸必須從細(xì)胞或其它生物物質(zhì)中釋放出來。細(xì)胞裂解可通過機械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實現(xiàn)。核酸的高電荷磷酸骨架結(jié)構(gòu)，決定了核酸比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其它生物大分子物質(zhì)更具親水性，根據(jù)組織中各種成分的理化性質(zhì)不同，來分離組織中的各種多余成分，利用選擇性沉淀等方法可以將核酸進行分離與純化。利用氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì)變性，從而提高提取效率。裂解后離心，疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。吸取上層水相再加入異丙醇可使核酸濃縮形成沉淀，經(jīng)離心收集核酸沉淀，再用75%的乙醇漂洗以除去多余的鹽分，即可獲得純化的核酸。

5 核酸提取注意事項

5.1 避免污染。

一是避免樣品對操作人員感染；二是避免操作人員對樣品污染；三是避免樣品間的交叉污染，如果出現(xiàn)樣品污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

5.2 細(xì)心操作提高核酸產(chǎn)率。

核酸容易斷裂，稍有不慎就會出現(xiàn)核酸斷裂或流失，從而產(chǎn)生核酸產(chǎn)量過低或沒有產(chǎn)量，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

5.3 在提取RNA時，注意控制RNA酶的活性。

玻璃器皿、操作人員的手上以及毛發(fā)、被污染的試劑均有可能存在RNA酶，必須小心、謹(jǐn)慎操作避免RNA酶將核酸降解。

5.4 序列的反應(yīng)體系中進行30個循環(huán)就可以收到理想的效果，時間過長，實驗效率將降低。

6 PCR實驗技術(shù)注意事項

6.1 防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染。解決辦法如下：

6.1.1 在裝有紫外燈的工作臺內(nèi)加PCR試劑，凡不用工作臺時應(yīng)打開紫外燈。工作臺內(nèi)始終放置PCR專用的微量離心機、一次性手套、整套移液器和其它必需品。所有緩沖液、吸頭和離心管使用前必須經(jīng)高壓處理。

6.1.2 進入PCR配液區(qū)，應(yīng)戴上一副新手套并勤于更換。

6.1.3 所有試劑應(yīng)專人專用，并進行必要的標(biāo)注，以便相互區(qū)分，并分裝成小包裝，這些試劑不得用于其它用途。

6.1.4 裝有PCR試劑的離心管使用前應(yīng)瞬時離心，從而減少污染手套和移液器的機會。

6.1.5 最好的操作程序是，先加完其它所有成分之后，再加DNA模板，然后蓋好蓋子，瞬時離心。

6.1.6 加DNA模板時避免形成污染，拿過DNA模板后建議更換手套。

6.1.7 設(shè)立陰、陽性對照，陰陽性對照最好在不同的專用區(qū)域配制，以防污染。

6.2 提高擴增效率，增加擴增產(chǎn)物。

6.2.1 優(yōu)化反應(yīng)體系，以使體系中各成分濃度及相互間比例適合，PCR反應(yīng)才能正常進行。

6.2.2 優(yōu)化反應(yīng)程序，以最大程度發(fā)揮各成分的作用，達到較高的擴增效率，從而能收到更多的擴增產(chǎn)物。（編輯：郭遠(yuǎn)）