周志成 王惠林 王賢磊 李冠

摘 要： 為明確甜瓜品種‘紅月亮F1代的種子純度，通過提取甜瓜‘紅月亮子葉DNA，利用SSR（Simple Sequence Repeats）分子標記對甜瓜品種紅月亮F1代種子DNA進行了PCR擴增、檢測與分析。結(jié)果表明，在20個SSR引物組合對親本及F1代篩選中，共有6對引物組合具有多態(tài)性，多態(tài)率30%。選擇CMBR026用于‘紅月亮F1代種子純度鑒定，使用該標記共檢測118株，其中2株為自交株，種子純度為98.3%；試驗用的‘紅月亮種子田間鑒定純度為99.5%，鑒定結(jié)果一致。SSR分子標記方法更能準確鑒別出‘紅月亮中的不純株，且大大縮短純度鑒定周期。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 紅月亮； SSR； 純度鑒定

Genetic Purity Test of Melon Variety ‘Red Moon F1 Using SSR Marker

ZHOU Zhi-cheng1， WANG Hui-lin1，2， WANG Xian-lei2， Li Guan2

（1. College of Forestry and Horticulture， Xinjiang Agriculture University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2. College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi， Xinjiang 830046， China）

Abstract： DNA of melon‘Red Moonand its parents was extracted from cotyledon and analyzed by SSR（Simple Sequence Repeats）markers. In 20 SSR primer combinations screened 6 primer combinations were polymorphic between parents，and the polymorphic rate was 30%. CMBR026 was selected for genetic purity. 118 seeds were tested using this marker，2 seeds were off-type. The same seed lot was also tested in the field and the purity was 99.5%. SSR molecular marker method can accurately test genetic purity of ‘Red Moonand greatly shorten time of the test.

Key words： Melon； Red Moon； SSR； Purity test

甜瓜是傳統(tǒng)的特色水果和新疆主要的經(jīng)濟作物，培育高抗病的優(yōu)良品種一直是廣大育種工作者的目標。目前，我國生產(chǎn)中已廣泛使用雜交品種[1]。種子純度是種子質(zhì)量的重要指標，近年來甜瓜生產(chǎn)中由于雜交種子純度不達標，引起的種子糾紛時有發(fā)生，給農(nóng)民造成一定的經(jīng)濟損失，對社會穩(wěn)定造成不良影響[2]，因此為了保護種子經(jīng)營及農(nóng)民的利益，研究并建立每個品種快速、準確有效的種子純度鑒定方法是非常重要的。目前鑒定甜瓜雜交種子純度主要為2大類，一類是主要采用田間種植鑒定方法[3]，第2類就是利用目前的分子標記、生化等方法在實驗室內(nèi)進行種子真實性檢測。田間植株性狀鑒定需占用土地，費時費工，且北方生產(chǎn)的種子當年在北方無法實施田間鑒定，只能大棚鑒定[4]以及南繁鑒定[5]，更增加了生產(chǎn)成本。實驗室檢測主要為生化檢測以及分子標記檢測。生化檢測中利用同工酶和蛋白質(zhì)電泳，靈敏度高、較田間檢測易操作等優(yōu)點曾被大量應用于雜交種的檢測中[6]。但同工酶位點和蛋白質(zhì)種類有限，對于親緣關(guān)系很近的雜交種難以區(qū)分[7]。DNA標記所檢測的是作物基因組DNA水平的差異，因而非常穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定遺傳[8]，可反映生物的個體和群體特征。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分子標記用于作物遺傳作圖，種質(zhì)純度的鑒定[3，9-10]。同時也有多種分子標記應用于甜瓜種子純度的鑒定[11]。例如RAPD分子標記[12]，ISSR分子標記[13-14]，SSR分子標記[1]，SRAP分子標記[15]。

‘紅月亮F1代甜瓜是2005年由新疆西域種業(yè)股份有限公司選育，該品種單果質(zhì)量2 kg左右，果實為圓球形，果皮金黃色光滑，果肉橘黃色肉質(zhì)脆，中心可溶性固形物含量14%～16%，口感品質(zhì)優(yōu)，植株易坐果，商品率高，耐低溫弱光；適于設(shè)施保護地栽培；該品種在山東、海南等地試種推廣市場反映表現(xiàn)較好，具有早熟、可溶性固形物含量高、品質(zhì)口感好且外觀美等特點。目前該品種F1代商品種子主要于秋季在海南采用田間種植鑒定，鑒定結(jié)果一般于次年1—2月完成；而設(shè)施生產(chǎn)上種子需求高峰期通常在每年的11—12月。為了適應生產(chǎn)需求，必須探索出適應設(shè)施生產(chǎn)要求的快速、準確的種子純度鑒定方法。本試驗探討了采用SSR標記進行甜瓜品種‘紅月亮F1代種子純度鑒定的可行性及準確性。篩選SSR標記并對甜瓜品種‘紅月亮F1代種子純度進行鑒定與分析，與田間鑒定相比，SSR標記方法更能準確鑒別出‘紅月亮中的不純株，且大大縮短純度鑒定周期。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為甜瓜品種‘紅月亮F1代商品種及其親本‘M627（母本）和‘M540（父本），雜交后代和親本依據(jù)田間實驗及室內(nèi)實驗需求，分別種植于國家瓜類工程中心和新疆大學生物工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 田間鑒定種子純度 2012年在新疆昌吉國家瓜類工程技術(shù)研究中心試驗田種植‘紅月亮 F1代幼苗200株，通過觀察植株與果實形態(tài)鑒定種子純度。

1.2.2 實驗室檢驗種子純度 分為以下幾個步驟。

1）DNA的提取 將供試材料分別于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行播種育苗， 溫度28 ℃，日照16 h?！甅627（母本）及‘M540（父本）20株，‘紅月亮雜交后代商品種150株。待幼苗長出真葉時，從親本中隨機選擇植株，混合葉片為材料，采用CTAB[16]法分別提取父本和母本的DNA。同時利用多樣品組織研磨機Tissuelyser-24，采用CTAB法，分別提取150株‘紅月亮DNA。

2）SSR標記PCR擴增 PCR擴增程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 復性30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。反應的基本體系為：反應體系總體積為20 μL，含DNA 100 ng，dNTPs0.2 mmol·L-1，Mg2+ 1.5 mmol·L-1，上、下游引物各0.2 μmol·L-1，Taq DNA polymerase 1 U，10×PCRbuffer 2 μL，補足超純水20 μL。

3）PCR擴增產(chǎn)物的檢測 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測擴增引物。聚丙烯酰胺凝膠的組分為：總體積50 mL，含尿素21 g，超純水17 mL，5×TBE 10 mL，19 ∶ 1丙烯酰胺7 mL，10% APS 225 μL，TEMD 50 μL。取4 μL擴增產(chǎn)物，加入4 μL Loading buffer（甘油含量為30%），進行電泳。電泳40 min后，將膠置于10% 的乙醇10 min，蒸餾水漂洗，置于1% HNO3 中浸泡6 min，蒸餾水漂洗，0.1% 的AgNO3浸泡10 min置于加入 3% 的Na2CO3和0.1% 的甲醛混合液顯色3～6 min，用10%的冰乙酸2～3 min終止顯色，蒸餾水漂洗空干。

4）多態(tài)SSR引物的篩選 從‘紅月亮中選取20株DNA進行混合，與其父本母本DNA對照，在20對引物組合中篩選擴增帶型清晰，有多態(tài)的SSR引物。其中條帶清晰共顯性的引物最適。SSR引物序列信息見表1，引物由華大基因合成。

5）‘紅月亮種子純度的鑒定 采用篩選出的最適SSR引物組合擴增全部‘紅月亮F1代實驗植株，擴增結(jié)果經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，分析鑒定種子純度。種子純度/%=（1-雜株個體數(shù)/F1個體總數(shù)）×100[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間鑒定種子純度

田間種植鑒定‘紅月亮F1代種子，經(jīng)過田間觀察F1代植株與果實性狀多數(shù)表現(xiàn)一致，200株中只有1株與母本表型一致，因此田間鑒定純度為99.5%。

2.2 實驗室鑒定種子純度

2.2.1 育苗 根據(jù)室內(nèi)實驗需求，將供試材料‘M627（母本），‘M540（父本）及‘紅月亮F1代雜交種種植于培養(yǎng)箱中。溫度28 ℃，日照16 h。待幼苗長出真葉開始提取材料的DNA。

2.2.2 多態(tài)SSR引物的篩選 應用20對SSR引物組合（表1）分別對‘M627（母本），‘M540（父本）及‘紅月亮F1代進行PCR擴增分析。電泳檢測結(jié)果顯示，表現(xiàn)出多態(tài)性的SSR引物共有6對，分別為1號CMN22-22、3號MU9717、4號CMBR026、5號CMGA128、10號MU7194、14號CMBR139多態(tài)率達30%（圖1）。

上述具有多態(tài)性的SSR引物可用于下一步的雜交種子純度鑒定。其中PCR產(chǎn)物條帶清晰且為共顯性的SSR標記為最適引物， CMBR026擴增結(jié)果為：母本為擴增出低帶，父本擴增出高帶，F(xiàn)1代為雙帶。選擇4號SSR標記CMBR026用于‘紅月亮種子純度鑒定。

2.2.3 ‘紅月亮F1代種子純度的鑒定 用SSR標記CMBR026擴增140株‘紅月亮F1個體，進行F1種子純度鑒定。PCR擴增獲得約140 bp的PCR產(chǎn)物，進行經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果顯示

（圖2），泳道空的PCR未擴增出的個體，不計入有效結(jié)果。其中1號為母本，2號為父本，3號為純的‘紅月亮個體。箭頭指示4號為母本基因型不純個體，30號為父本條帶，有可能是收種混入的摻雜個體。其余個體結(jié)果圖未給出，也未進行數(shù)量統(tǒng)計。使用該標記檢測共檢測118株，2株不純，種子純度為 98.3%。

3 討 論

種子純度是種子質(zhì)量的重要指標，對甜瓜作物產(chǎn)量及品質(zhì)有直接影響。目前，甜瓜品種種子純度的鑒定方法主要采用田間種植鑒定，憑借田間植株及果實的形態(tài)鑒定，進行早期鑒定比較困難[15]。以本研究中的供試材料‘紅月亮種質(zhì)鑒定結(jié)果一般于次年1—2月完成，而設(shè)施生產(chǎn)上種子需求高峰期通常在每年的11—12月，傳統(tǒng)方法很難滿足生產(chǎn)中的需求。其他作物如小麥、苦瓜、黃瓜等已經(jīng)實現(xiàn)實驗室完成種子純度的鑒定[17-19]。分子標記在植物苗期就能進行檢測。SSR分子標記是一種共顯性標記，能夠明顯區(qū)別親本與雜合個體，結(jié)果更為準確。同時，結(jié)合多通量DNA提取技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)大量快速完成甜瓜種質(zhì)純度的鑒定。

本研究首次使用SSR分子標記對‘M627（母本）和‘M540（父本）及雜交后代‘紅月亮進行種子純度的鑒定。研究中，‘紅月亮個體數(shù)為140，其中有效個體數(shù)為118，占84.28%。通過SSR分子標記CMBR026對118株個體進行純度鑒定，2株不純，種子純度為98.3%，不純植株中純合母本基因型1株，推測為雜交時母本去雄不徹底等原因造成，純合父本1株，推測為種子機械摻雜造成。本研究中田間鑒定結(jié)果為純度99.5%，與田間鑒定相比，SSR分子標記方法更能準確鑒別出‘紅月亮中的不純株，且大大縮短純度鑒定周期。

本研究證明SSR分子標記能用于該品種的種子純度鑒定，這為研究適應設(shè)施生產(chǎn)要求的快速、準確的種子純度鑒定方法奠定了基礎(chǔ)。然而在前期工作者的研究中發(fā)現(xiàn)，甜瓜雜交后代種質(zhì)純度鑒定由于不同品種的遺傳背景不同，不同雜交后代的親緣遠近不同，單一的標記就無法實現(xiàn)準確鑒定純度。這時對用于鑒定的標記需要進行篩選，也許會同時需要幾個標記輔助鑒定。目前來看分子標記進行甜瓜種子純度的檢測是可行的，但推廣到不同的品種還需要進一步研究，分子標記進行種質(zhì)純度的研究有廣闊的研究前景。

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