毛少偉 卿晨 鄒桂花 羅甜 譚鋼

【摘要】目的 觀察僅α硫辛酸（ALA）對外源性H202誘導的人視網膜色素上皮細胞ARPE-19細胞表達血紅素氧合酶（HO-1）的影響，并探討其可能的分子機制。方法 體外培養(yǎng)人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19細胞，用12.5mmol/L外源性過氧化氫（H2O2）作用30min后，再加入不同濃度ALA作用不同時間。RT-PCR和Western blot分別檢測HO-1 mRNA和蛋白的表達。熒光探針法觀察ROS的產生。同時分別采用HO-1的激動劑CoPP和抑制劑ZnPP處理細胞，觀察ROS的變化。結果 ALA處理ARPE-19細胞后，可顯著誘導其表達HO-1 mRNA和蛋白，并呈一定的劑量依賴性。同時，H2O2處理后能顯著誘導ARPE-19細胞產生ROS，而經不同濃度ALA處理后，ROS產生顯著降低。結論 α-硫辛酸誘導氧化應激下人視網膜色素上皮細胞表達HO-1，從而抑制ROS的過度產生。

【關鍵詞】α-硫辛酸；氧化應激；血紅素氧合酶-1；活性氧

年齡相關性黃斑變性（Age-related Macular Degeneration，AMD）是一種隨年齡增長出現的雙側、進行性視網膜黃斑部退行性病變，是發(fā)達國家最常見的不可逆性致盲眼病，也是我國50歲以上人群中最重要的致盲性疾病之一。AMD的病理改變主要累及視網膜色素上皮（RPE）、感光細胞層和脈絡膜界面。RPE細胞都是病變的中心環(huán)節(jié)之一，RPE具有很高氧化應激易感性。因而長期氧化應激導致的RPE細胞結構與功能異常被認為是引發(fā)AMD的重要原因。α硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）是一種理想的生物抗氧化劑，它廣泛存在于自然界中，具有強大的抗氧化作（是維生素C的400倍），也是存在于線粒體內的輔酶，生物相容性和利用度很好[1]。本研究試圖證實ALA對氧化應激下RPE細胞的保護作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

熒光染料H2DCFDA購自Molecular Probes公司。H2O2、鈷原卟啉 IX（CpPP），錫原卟啉IX（SnPP）為Sigma-Aldrich產品為Sigma產品。HO-1多克隆抗體購自Santa Cruz。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物。其余分析純產品主要購自上海生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

ARPE-19細胞用含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。實驗分為正常對照組、H2O2處理組和ALA干預組。其中對照組僅加入等體積培養(yǎng)基。H2O2組細胞加入12.5mol/L H2O2培養(yǎng)30min；ALA不同濃度干預組：ARPE-19細胞經H2O2作用后，再加入10，20和30μmol/L ALA作用4h。

1.3 RT-PCR

采用Trizol提取RNA，并根據試劑盒提供的步驟進行RT-PCR。HO-1-mRNA 表達水平以β-actin 為內對照，逆轉錄參照TaKaRa 公司試劑盒說明書進行。陰性對照用每個樣本直接行PCR，不加引物和摸板。擴增產物經瓊脂凝膠電泳，紫外燈下照像，在圖像分析系統(tǒng)上進行密度掃描，用HO-1 基因擴增產物的密度與β-actin基因擴增產物的密度比值表示HO-1的基因表達水平。

1.4 Western blot

根據試劑盒（江蘇碧云天）提供的方案獲取細胞總蛋白。收集蛋白后進行SDS-PAGE并轉印至硝酸纖維素膜上。隨后用含0.1%吐溫-20和5%脫脂奶粉的TBS封閉，孵育一抗、二抗，ECL顯影。

1.5 ROS檢測

以H2DCFDA為熒光探針檢測細胞內ROS水平。其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進入細胞后能被過氧化物、氫過氧化物等氧化分解為二氯熒光黃而產生熒光。孵育結束后，向各管中加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細胞3次，重懸細胞，熒光分光光度計檢測細胞懸液熒光強度（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計學軟件處理數據，結果采用均數±標準差表示，多組比較采用one-way方差分析并行Students t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ALA對ARPE-19細胞mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，陰性對照組HO-1表達水平極低，H2O2處理后，HO-1僅有輕微增高。隨著ALA劑量的增加，HO-1表達逐漸增多（圖1）。

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圖1. ALA對HO-1 mRNA表達的影響

1：Marker；2：陰性對照；3：H2O2；4：10μmol/L ALA；5：20μmol/L ALA；6：30μmol/L ALA2.2 ALA對ARPE-19細胞蛋白表達的影響

Western blot結果與RT-PCR類似，HO-1蛋白的表達水平隨著ALA濃度的增加，而增高。內參β-actin在所有組中保持恒定（圖2）。

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圖2. ALA對HO-1 mRNA表達的影響

1：陰性對照；2：H2O2；3：10μmol/L ALA；4：20μmol/L ALA；5：30μmol/L ALA

2.2 ALA對H2O2誘導ARPE-19細胞產生ROS的影響

陰性對照組僅表達少量ROS，H2O2處理后ROS水平顯著增高。ALA處理后，ROS的水平逐漸降低（圖3）。

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圖3. ALA對ARPE-19細胞產生ROS的影響

1：陰性對照；2：H2O2；3：10μmol/L ALA；4：20μmol/L ALA；5：30μmol/L ALA

3 討論

ROS是指化學性質活潑、氧化能力強大的一類含氧物質，包括自由基、過氧化氫（H2O2）等；在生物體內，ROS是一種非常重要的生物信號傳導介質，但ROS的異常增多可導致脂質的氧化、蛋白質的破碎、交聯(lián)與聚集，同時還可導致DNA堿基的氧化。最終可造成細胞的功能障礙及死亡。視網膜是人體氧化反應最劇烈的組織之一，而黃斑區(qū)為了實現視覺的敏銳度，排列有極高密度的視錐細胞，而血供卻極其有限，使得其更易成為氧化損傷的靶點。PRE細胞富含脂褐質、黑色素、黃素、細胞色素C等光敏色素，在持續(xù)的光照下特別容易積累光氧化損傷[2]。RPE對光感受器外節(jié)盤膜的吞噬也為其帶來進一步的氧化應激負擔。老年人的RPE細胞中的溶酶體吞噬能力和過氧化物酶的活性明顯下降，因此衰老的RPE細胞更加容易受到氧化應激的損傷。ALA又被稱為“全能抗氧化劑”，臨床已被廣泛用于治療和預防心臟病、糖尿病等疾病，被證實對心肌細胞、胰腺B細胞，神經細胞等多種細胞具有保護作用。本研究發(fā)現，ALA處理后，可顯著誘導HO-1表達。HO-1是血紅素代謝的關鍵限速酶。研究表明HO-1 及其代謝產物在維護細胞穩(wěn)態(tài)的過程中具有抗炎、抗增殖、抗氧化以及抗凋亡等作用[3]。例如，HO-1 表達的降低或缺失（藥物性抑制作用或HO-1 基因敲除小鼠）使機體對氧化應激的耐受性降低，從而誘發(fā)廣泛的氧化性損傷或器官衰竭，因此，ALA對AMD的保護作用可能通過上調HO-1表達而實現的。因為HO-1激動劑CoPP能進一步降低細胞內ROS水平，而其抑制劑ZnPP處理后則能逆轉此過程。

綜上所述，本研究初步證實ALA可能通過HO-1途徑抑制H2O2刺激下ARPE-19細胞ROS的產生，從而促ROS的清除，最終阻止或者延AMD的發(fā)生。

資助項目：國家自然科學基金（81100648）

參考文獻

[1]Rochette L， Ghibu S， Richard C， et al. Direct and indirect antioxidant properties of alpha-lipoic acid and therapeutic potential[J]. Mol Nutr Food Res， 2013，57（1）：114-125.

[2]Bertram KM， Baglole CJ， Phipps RP， et al. Molecular regulation of cigarette smoke induced-oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells： implications for age-related macular degeneration[J]. Am J Physiol Cell Physiol， 2009，297（5）：C1200-1210.

[3]Synowiec E， Szaflik J， Chmielewska M， et al. An association between polymorphism of the heme oxygenase-1 and -2 genes and age-related macular degeneration[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（3）：2081-2087.