林翔凱 張龍濤 陳潔 陳玲 鄭寶東

摘 要 以紫薯多糖為原料，研究不同酶添加量、時間、溫度和pH值對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響。通過正交試驗法得到酶法脫除紫薯多糖中蛋白的最優(yōu)工藝，并與Sevag法和三氯乙酸法相比較。結(jié)果表明：酶法是最佳的脫蛋白方法，其脫蛋白最佳工藝為：酶添加量為460 U/mL，溫度為50 ℃，時間為60 min，蛋白質(zhì)脫除率為87.71%，多糖的損失率為29.55%。

關(guān)鍵詞 紫薯；多糖；酶法；脫蛋白

中圖分類號 TS255.36 文獻標(biāo)識碼 A

紫薯[（Ipomoea batatas（L.）Lam）]又稱紫甘薯、黑薯，薯皮、薯肉分別呈紫黑、紫紅色，是甘薯的一種特有品種，在中國河南、廣東、福建、河北、廣西等地區(qū)均有廣泛種植[1-3]。已有研究結(jié)果表明，紫薯含有多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、色素等功能性成分，具有很強的抗氧化能力[4-5]，還可預(yù)防高血壓[6]、改善肝功能[7]、抗腫瘤[8]及抑制誘癌物質(zhì)的產(chǎn)生[9]。近年來，對于紫薯保健作用和藥用價值的研究越來越受到人們的重視。

多糖類物質(zhì)廣泛存在于動物、植物和微生物的細(xì)胞壁中，是生物體內(nèi)除核酸、蛋白質(zhì)外的又一類重要生物分子，具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等生物活性[10-12]。水提法得到的植物粗多糖中常含有較多的以糖蛋白復(fù)合物形式存在的蛋白雜質(zhì)，脫除難度較大，從而影響了紫薯多糖結(jié)構(gòu)和功效的進一步研究。因此，如何在高效脫除蛋白質(zhì)的同時盡可能地保留多糖是多糖純化過程中需要解決的難題，也是制備多糖純品的必要步驟。

目前，國內(nèi)外粗多糖脫蛋白的方法主要有Sevag法、鹽酸法、酶法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法等[13-15]。對紫薯粗多糖脫蛋白的報道還較少，尚未見采用酶法對紫薯粗多糖進行脫蛋白的相關(guān)報道，因此筆者采用酶法對紫薯粗多糖進行脫蛋白，通過正交試驗對其工藝進行優(yōu)化，并與Sevag法和三氯乙酸法作對比，為紫薯多糖的分離純化提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 紫薯（紫羅蘭品種）購自福建長樂。

1.1.2 藥品或試劑 木瓜蛋白酶購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán) G-250、無水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉等均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

1.1.3 設(shè)備或儀器 Phs-3C型精密pH計購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；AL104型精密分析天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FZ102植物粉碎機購自天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購自上海亞榮生化儀器廠；L530型臺式低速離心機購自長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；丹瑞HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋購自江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；試驗標(biāo)準(zhǔn)篩購自上虞市銀河測試儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 紫薯多糖的提取 紫薯洗凈、去皮、切片→烘干（45 ℃， 6 h）→粉碎、過篩（60目=250 μm）→熱水浸提（70 ℃、 3 h）→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（55 ℃）→95%乙醇沉淀→離心→水溶解→粗多糖溶液。

1.2.2 多糖含量的測定[16-17] （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取經(jīng)干燥的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg，定容至500 mL，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水補至2.0 mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，顯色后于冷水中冷卻15 min。以水代替糖溶液作空白對照，于490 nm處測定吸光度。得到回歸方程為：

Y=6.623 2X+0.001 6（R2=0.998 8）

其中X：葡萄糖溶液濃度，單位mg/mL；Y：吸光度OD值。

（2）樣品中多糖含量的測定：吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測定吸光度，代入回歸方程計算多糖含量。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定[18] （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，依次置于6支試管中，分別加入去離子水補至1 mL，搖勻。每管中加入5.0 mL染色液，搖勻，室溫靜置3 min。以空白溶液作對照，于595 nm波長處測定吸光度。得到回歸方程為：

Y=4.995 7X+0.009 4（R2=0.995 0）

其中X：牛血清白蛋白溶液濃度，單位mg/mL；Y：吸光度OD值。

（2）樣品中蛋白質(zhì)含量的測定：吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測定吸光度，代入回歸方程計算蛋白質(zhì)的含量。

1.2.4 酶法脫蛋白試驗 （1）單因素試驗：考察木瓜蛋白酶添加量：60、160、260、360、460 U/mL（溫度60 ℃、時間60 min、pH為原液pH6.98），溫度：20、30、40、50、60、70 ℃（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、時間60 min、pH為原液pH6.98），時間：40、50、60、70、80、90 min（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、溫度60 ℃、pH為原液pH6.98）和pH值：4.00、5.00、6.00、6.98、8.00、9.00（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、溫度60 ℃、時間60 min）這些因素對蛋白質(zhì)脫除率的影響。酶解液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液測定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

（2）正交試驗：在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇影響蛋白脫除率較大的3個因素進行正交試驗，得到酶法脫除紫薯粗多糖中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。

1.2.5 Sevag法 取多糖樣品液40 mL，加入10 mL Sevag試劑[氯仿 ∶ 正丁醇=4 ∶ 1（V ∶ V）]。將混合物劇烈振搖20～30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，除去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。取少量溶液測定多糖和蛋白質(zhì)含量，再向溶液中加入其1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述步驟5次。

1.2.6 三氯乙酸法 取多糖樣品液50 mL，加入50 mL的3%三氯乙酸，使溶液完全混合均勻。于5～10 ℃冰箱中放置過夜，離心除去沉淀，測定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

1.2.7 計算公式 多糖損失率=（C1-C2）/C1×100%

其中，C1：處理前的多糖濃度（mg/mL），C2：處理后的多糖濃度（mg/mL）。

其中，C3：脫蛋白前的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），C4：脫蛋白后的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶添加量對紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖1可知，蛋白質(zhì)脫除率隨著酶添加量的增加而增大，在460 U/mL時達到最大；多糖損失率也隨著酶添加量的增加而緩慢增大。這可能是因為保持反應(yīng)體系中其它成分不變，隨著酶濃度的上升，酶與底物接觸的機會增加，蛋白質(zhì)脫除效果明顯增大；而多糖有一部分發(fā)生水解，并且隨著蛋白質(zhì)脫除率的增大也造成多糖的一部分損失，但并不明顯。同時，在酶添加量為460 U/mL時蛋白質(zhì)脫除率已高達88.47%，考慮到酶的成本與生產(chǎn)效益及多糖的損失，選擇460 U/mL為酶解的最適酶添加量。

2.2 不同溫度對紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖2可知，在20～50 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)脫除率基本不變；當(dāng)溫度高于50 ℃，蛋白質(zhì)脫除率顯著增加。這與酶的作用最適溫度有關(guān)，低溫抑制了酶的活性，而溫度大于50 ℃可激發(fā)酶的活性。多糖損失率隨著溫度的升高而增大，50 ℃后基本保持不變。這可能是因為酶促反應(yīng)的加劇造成部分多糖的損失，并且隨著溫度的升高部分多糖發(fā)生水解[19]。但多糖損失增大的趨勢并不明顯，因此選擇70 ℃為酶解的最適溫度。

2.3 不同時間對紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解時間在40～70 min 時，蛋白質(zhì)脫除率隨著時間的延長而增加，70 min后蛋白脫除率幾乎不變。這可能是因為在70 min時酶促反應(yīng)基本完成，當(dāng)酶濃度不變時，延長酶促反應(yīng)的時間并不能使蛋白質(zhì)脫除率顯著增加[13]。而多糖隨著反應(yīng)時間的延長發(fā)生部分水解，多糖損失率隨著時間的延長而緩慢增加。因此，選擇70 min為最佳酶解時間。

2.4 不同pH值對紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值為4.0時，蛋白質(zhì)基本被脫除干凈，隨著pH值的增大，蛋白質(zhì)脫除率顯著下降，在pH值為7.0～9.0時，蛋白質(zhì)脫除率基本保持不變，停留在20%左右的較低水平；而多糖損失率在酸、堿條件下顯著提高。這可能是因為酸、堿易造成糖苷鍵斷裂，使多糖發(fā)生水解。因此，選擇原液的pH為脫除蛋白質(zhì)的最適pH值既方便、效果也最好。

2.5 正交試驗

以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)，對酶添加量（A）、溫度（B）和時間（C）3個因素進行正交試驗，得到酶法脫除紫薯粗多糖中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。正交試驗因素水平表和正交實驗結(jié)果見表1和表2。

由表2可以看出，影響蛋白質(zhì)脫除率的主次因素是A>B>C。酶法脫除紫薯粗多糖蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝參數(shù)為A3B1C1，即酶添加量460 U/mL，溫度50 ℃，作用時間60 min。在此條件下，蛋白質(zhì)脫除率為87.71%，多糖損失率為29.55%。對正交實驗結(jié)果進行方差分析（表3），結(jié)果可以看出酶添加量達極顯著水平（p<0.01），溫度和時間對蛋白質(zhì)脫除率效果影響不顯著。

2.6 Sevag法脫蛋白

使用Sevag試劑對紫薯粗多糖溶液進行脫蛋白處理5次，蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率情況見表4。

表4可知，Sevag法脫蛋白3次后，蛋白質(zhì)脫除率穩(wěn)定，但多糖損失率卻逐漸上升。經(jīng)過5次脫蛋白后，蛋白質(zhì)脫除率只有64.99%，多糖損失率卻高達46.48%。因此選擇Sevag法脫蛋白3次為最佳，此時蛋白質(zhì)脫除率62.89%，多糖損失率31.19%。

2.7 不同脫蛋白方法的比較

對不同脫蛋白方法的蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率進行對比研究，由表5可知，酶法是最佳的紫薯粗多糖脫蛋白方法，蛋白脫除率可高達87.71%，而多糖損失率僅為29.55%。

3 討論與結(jié)論

本實驗以蛋白脫除率和多糖損失率為評價指標(biāo)，采用蛋白酶法、Sevag法和三氯乙酸法對紫薯多糖溶液進行脫蛋白處理，通過對比可知，Sevag法與三氯乙酸法脫蛋白工藝有機溶劑回收的工作量大，易造成環(huán)境污染，且多糖損失率較高；而酶法操作過程簡單，蛋白質(zhì)脫除效果最好，且多糖損失率較低，是最好的脫蛋白方法。其脫蛋白最佳工藝為：酶添加量460 U/mL、溫度50 ℃、酶解時間60 min。在此工藝條件下，紫薯多糖蛋白質(zhì)脫除率為87.71%，多糖的損失率為29.55%。

此結(jié)果與已報道的其它紫薯多糖脫蛋白的研究結(jié)果相一致。高秋萍等[19]采用Sevag法、三氯乙酸法、Sevag法和三氯乙酸法相結(jié)合的方法對紫薯多糖進行了脫蛋白，結(jié)果表明三氯乙酸法是相對較好的脫蛋白方法。賈琳璐[20]比較研究了Sevag法、三氯乙酸法、硫酸銨沉淀法對紫薯多糖的脫蛋白效果，結(jié)果表明Sevag法脫蛋白效率低，有機溶劑易殘留，且多糖的損失較大；三氯乙酸法脫蛋白效率較高，但容易引起多糖的降解；硫酸銨沉淀法為相對較好的脫蛋白方法，硫酸銨飽和度為40%，其蛋白質(zhì)脫除率為80.75%，多糖損失率為25.98%，此結(jié)果與酶法脫蛋白效果相似。但硫酸銨沉淀法與酶法相比操作更加繁瑣，耗時更久，而且會增加多糖溶液的體積，降低多糖溶液的濃度，影響對紫薯多糖的進一步研究。因此，酶法脫蛋白是相對較好的脫蛋白方法。

同時，張怡等[13]研究了金柑多糖酶法脫蛋白工藝，結(jié)果表明酶法脫蛋白的效率較高，蛋白質(zhì)脫除率可達75.88%，多糖的損失率為5.45%；張一芳等[21]研究了枸杞多糖酶法脫蛋白工藝，結(jié)果表明酶法脫蛋白效果優(yōu)于Sevag法，其蛋白質(zhì)脫除率為78.56%，多糖損失率為10.53%；邱承軍等[22]在研究酶法脫蛋白提取大棗多糖工藝時也證實了酶法脫蛋白效果最好。

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