張婷　史晉絨　宋柯　趙田田　劉莎　岳興建

摘要魚類體表粘液來自體表粘液細(xì)胞，其成分和量受到粘液細(xì)胞的分布、數(shù)量、發(fā)育情況以及外界環(huán)境的影響。粘液的主要成分是粘多糖和蛋白類，同時(shí)還含有少量脂質(zhì)。多糖類作為生物活性物質(zhì)，在抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等方面起到了重要作用。蛋白類的含量達(dá)55%，主要成分為88～95 kD的免疫球蛋白、溶菌酶、凝集素、補(bǔ)體、抗病毒蛋白/肽以及SOD酶，在魚類的生命活動(dòng)中有著重要意義。分離魚類體表粘液中生物活性蛋白的方法主要有柱層析法、鹽析法、離子交換層析法等。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究成果，對(duì)魚類體表粘液分泌機(jī)制、粘液的組分及Ig的分離、體表粘液的免疫功能研究和趨勢(shì)等方面進(jìn)行了綜述，旨在為今后體表粘液免疫蛋白的應(yīng)用研究提供切入點(diǎn)。

關(guān)鍵詞魚類；粘液；分泌機(jī)制；組分；功能

中圖分類號(hào)S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）22-07445-04

魚類體表皮膚腺層含有豐富的腺細(xì)胞，可分泌粘液覆蓋于魚類體表，鱗片缺少或不發(fā)達(dá)種類粘液分泌量更大[1]，其分泌物中含有粘多糖類和纖維等物質(zhì)，入水后纖維部分膨脹發(fā)粘成為粘液[2]。該粘液有凝結(jié)、沉淀水中的懸浮物質(zhì)，抵御異物和病原微生物入侵[3]，維持體內(nèi)滲透壓[4]，減小運(yùn)動(dòng)摩擦[5]，濕潤(rùn)皮膚，防止魚體短期離開水環(huán)境時(shí)皮膚干燥[6]等作用。在白斑鸚哥魚（Chlorurus sordidus）體表粘液能形成粘液繭，預(yù)防外來襲擊[7]。

20世紀(jì)70年代，國(guó)外學(xué)者開始對(duì)魚類的體表粘液功能及組分進(jìn)行了研究。Rombout等[8]和Smith等[9]提出真骨魚類可能存在一套獨(dú)立于血液免疫系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)——體表皮膚粘液系統(tǒng)。大量研究表明，魚類存在局部的皮膚粘液免疫系統(tǒng)[10]，具有一定的粘液細(xì)胞基礎(chǔ)[11]，能獨(dú)立完成抗原攝取、呈遞及抗體分泌功能[12]。在免疫后歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）血液中發(fā)現(xiàn)分泌型抗體并非由血清抗體轉(zhuǎn)化而來，證實(shí)魚類確實(shí)存在不同來源的免疫球蛋白（Ig）[13]；對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）皮膚離體培養(yǎng)試驗(yàn)表明皮膚能獨(dú)立分泌抗體[14]。國(guó)外在20世紀(jì)80～90年代從羊頭鯛（Archosargus probatocephalus）[15]、香魚（Plecoglossus altivelis）及硬頭鱒（Salmo gairdneri）等多種魚類皮膚粘液中發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白，對(duì)其理化特性進(jìn)行了闡述，并與血清在免疫原性等方面進(jìn)行了比較。國(guó)內(nèi)研究稍晚于國(guó)外，近年才開展了對(duì)草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鯉（Cyprinus carpio）、鯽（Carassius auratus）[16]、鱖（Siniperca chuatsi）[17]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[18]和歐洲鰻鱺[19]等魚類皮膚粘液中的免疫球蛋白以及斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）等魚類的皮膚等粘膜免疫組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并成功分離免疫球蛋白，對(duì)于魚類免疫以及魚病治療有著重大的意義。筆者結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究成果，對(duì)魚類體表粘液分泌機(jī)制、粘液的組分及Ig的分離、體表粘液的免疫功能研究及趨勢(shì)等方面進(jìn)行了綜述，旨在為今后體表粘液、免疫蛋白的應(yīng)用研究提供切入點(diǎn)。

1魚類體表粘液的分泌機(jī)制

1.1體表粘液細(xì)胞的類型魚類體表粘液的分泌細(xì)胞由表皮細(xì)胞衍生而來，可分為單細(xì)胞和多細(xì)胞2種。不同功能的細(xì)胞形狀也不同，分為棒狀、杯狀和囊狀3種，其中杯形細(xì)胞是最常見的腺細(xì)胞[2]。HID染色法和酸性條件下的阿利新蘭（Alcian blue，AB）染色及ABPAS染色法（過碘酸Shiff試劑與阿利新蘭聯(lián)合染色法）將鯉的粘液細(xì)胞分為囊狀、梨狀和杯狀3種類型[20]，但是Sinha[21]認(rèn)為粘液細(xì)胞的這3種不同形狀只是不同發(fā)育階段的不同表現(xiàn)形式。ABPAS染色對(duì)淡水白鯧（Colossoma brachypomum）的粘液細(xì)胞進(jìn)行染色，根據(jù)其形態(tài)分為球狀、囊狀及長(zhǎng)橢圓狀3種，再根據(jù)其著色情況分為不同亞型[22]。PAS染色對(duì)非洲肺魚（Protopterus annectens）的粘液細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察其形態(tài)和著色的差異，將其分為I、II和III 3種類型[23]。ABPAS法染色結(jié)果表明4種細(xì)胞因所含成分不同在染色中分別呈現(xiàn)紅色、藍(lán)色、紫紅色和藍(lán)紫色，因此大菱鲆（Psetta maxima）等魚類體表粘液細(xì)胞可以分為I、II、III和IV型，目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)學(xué)者也按照這種方式對(duì)粘液細(xì)胞進(jìn)行分類[24-25]。粘液細(xì)胞由普通的表皮細(xì)胞發(fā)育而來，其發(fā)育期分為形成、成熟、功能和退化4個(gè)時(shí)期[21]。

1.2魚類體表粘液細(xì)胞的分布魚類的體表分布著大量的粘液細(xì)胞。不同種類魚類的粘液細(xì)胞數(shù)量及分布存在差異，同一個(gè)體體表粘液細(xì)胞也呈不均勻分布狀態(tài)。魚類體表的粘液細(xì)胞無鱗處粘液細(xì)胞較有鱗處多[25-26]，鰭處粘液細(xì)胞較其他部位少，且從魚頭至魚尾呈減少的分布趨勢(shì)[27]。環(huán)境也是影響體表粘液細(xì)胞數(shù)量和分布的重要因素，如生活在深層的魚類粘液細(xì)胞比生活在淺層的多[28]；在溫度不斷升高的外界刺激下大菱鲆體表皮膚不同部位粘液細(xì)胞的分布與數(shù)目發(fā)生顯著的變化，與常溫[（16±0.5） ℃]環(huán)境相比，II型粘液細(xì)胞增幅最大，IV型次之，I型變化不顯著，而III型增幅呈現(xiàn)出無規(guī)律性[25]。

1.3外界環(huán)境對(duì)皮膚粘液分泌的影響

1.3.1溫度。溫度對(duì)魚類體表粘液的分泌量、成分及活性有著顯著的影響。在一定范圍內(nèi)隨外界溫度的升高，魚類體表粘液分泌量也逐漸增加[29]，且其酸性粘液成分顯著增高，可有效防止病原菌的侵入[25]。用干的海膽精液接種不同溫度下的鯉和鯽[30]，在25 ℃下產(chǎn)生特異性凝集抗體的時(shí)間比在28 ℃下至少晚了4 d；在19.8～29.8 ℃溫度范圍內(nèi)，溫度較高時(shí)抗體形成快，峰值出現(xiàn)時(shí)間早，且抗體滴度明顯增高[17]；牙鲆在最適生理生活溫度（21 ℃）下，抗體應(yīng)答強(qiáng)度最大[18]。但是，在高溫條件下魚類的體表粘液細(xì)胞失活，體表粘液變性。在泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）體表粘液的流變行為研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)粘液變性，表現(xiàn)出不同的流變行為[31]。

1.3.2滲透壓。滲透壓對(duì)魚類體表粘液的分泌量及成分也有明顯影響。將海水魚轉(zhuǎn)移到淡水中，其體表粘液的蛋白組分以及含量都會(huì)發(fā)生明顯的變化[32-33]。浸泡菌苗的溶液中加入高滲食鹽后可明顯促進(jìn)魚體對(duì)疫苗的吸收，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)，增加粘液中免疫蛋白的分泌量[34]。高滲食鹽液可以提高免疫的相對(duì)免疫期和免疫率，據(jù)此推斷NaCl可以促進(jìn)魚類的微循環(huán)，提高機(jī)體對(duì)抗原的吸收，繼而促進(jìn)體表粘液中免疫蛋白的產(chǎn)生[35]。

1.3.3其他因素。影響魚類體表粘液蛋白組分及含量的因素除了溫度和滲透壓外，還有鹽度[36]、病原體微生物[37-38]、物理刺激等因素?？傊?，粘液細(xì)胞在一定限度內(nèi)對(duì)外界的物理、化學(xué)及生物刺激等脅迫具有保護(hù)性反應(yīng)作用，但超過其最大限度，粘液細(xì)胞將遭到破壞，失去其生物活性功能[39]。

綜上所述，魚類粘液細(xì)胞的種類主要用染色的方式來區(qū)分，可根據(jù)其著色差異和形狀的不同分類。用PAS染色將粘液細(xì)胞分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4種類型，這也是目前運(yùn)用最廣泛的分類方法。粘液細(xì)胞在不同魚類體表的分布具有差異性，鱗片豐富的部位粘液細(xì)胞較鱗片缺少的多，且在魚類體表面呈現(xiàn)出從魚頭至魚尾逐漸減少的趨勢(shì)。粘液細(xì)胞的分布除受到魚類自身的影響外，也受到滲透壓、溫度等外界環(huán)境的影響。另外，溫度和滲透壓對(duì)粘液的分泌量、成分及活性也有顯著的影響。在一定范圍內(nèi)，隨著外界溫度的升高，魚類體表粘液分泌量也逐漸增加，且其酸性粘液成分的增加更加顯著。適當(dāng)升高滲透壓有利于提高免疫的相對(duì)免疫期和免疫率，促進(jìn)魚體微循環(huán)，增加免疫蛋白的分泌量。

2魚類體表粘液的組分及Ig的分離與提純

2.1魚類體表粘液的組分魚類體表粘液主要成分是蛋白類，其含量約55%[40]，其中免疫蛋白Ig、溶菌酶、補(bǔ)體、凝集素和一些抗病毒（細(xì)菌）蛋白和肽類在魚類的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用[41]。魚類的體表粘液含有許多抗菌物質(zhì)（如抗菌肽、溶菌酶、凝集素和蛋白酶等），并且在許多魚類的皮膚粘液中發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶和組織蛋白酶L和B；另外，還含有溶血素及某些有毒成分，但其有毒成分的具體種類尚不清楚[42]。魚類的體表皮膚粘液中還含有對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）。研究發(fā)現(xiàn)泥鰍的體表粘液中含有SOD酶，其活性達(dá)到65 U/ml[43]。對(duì)烏鱧（Channa argus）注射鰤（Seriola Quinqueradiata）諾卡氏菌，發(fā)現(xiàn)其體表粘液的SOD活性顯著增高[44]。黃鱔（Monopterus albus）[45]、鲇（Silurus asotus）[46]等無鱗魚類體表粘液中還含有多糖類，作為生物活性物質(zhì)在抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等方面起到重要作用[40]。

純化的Ig可表現(xiàn)出多種不同聚合體，魚類血清中完整的Ig以四聚體或其他多聚體形式存在[16，47]。其中，二聚體Ig分子量約88～95 kD，包括H鏈和L鏈，分子量分別在68～72和25～29 kD。從羊頭鯛的皮膚粘液中分離純化出了二聚體和四聚體2種類型的Ig：二聚體Ig分子量為95 kD，四聚體Ig分子量為700 kD，由2條H鏈和2條L鏈組成[15]。在變性還原條件下，歐洲鰻鱺的皮膚粘液Ig重、輕鏈分子量分別為68和26 kD，還有1條分子量約為18 kD的蛋白帶；在非變性還原條件下，其皮膚粘液Ig只有1條蛋白帶，分子量約為350 kD，略呈擴(kuò)散拖帶現(xiàn)象[19]。鯽皮膚粘液分子質(zhì)量也存在88 kD的Ig重鏈分子[16]。鱖（Siniperca chuatsi）皮膚粘液中的分離純化的部分免疫球蛋白，其重鏈和輕鏈分子質(zhì)量分別為72和29 kD，與鱖血清中IgM的重鏈、輕鏈分子質(zhì)量相同[17]。另外，還含有43 kD的蛋白帶，可能是鱖皮膚粘液中另一種形式的重鏈[17]。在赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）血清與皮膚粘液中發(fā)現(xiàn)，血清蛋白與粘液蛋白有9條帶的分子量相同，推測(cè)其中大小為25和73.2 kD的2條帶分別為IgM的輕鏈和重鏈分子[48]，而從鲇體表皮膚粘液中也分離出了重鏈和輕鏈分別為78和26 kD的IgM[49]?？寡丽已錓g重鏈的單克隆抗體只與粘液蛋白中的72 kD條帶反應(yīng)，并確定此蛋白為牙鲆皮膚粘液的重鏈[18]；在此基礎(chǔ)上，又分離出分子質(zhì)量為72和26 kD的2個(gè)條帶，并認(rèn)為這2條帶是牙鲆粘液的重鏈和輕鏈[50]。陳成勛等[51]用Sephadex G50凝膠層析分離得到2個(gè)洗脫峰，并且這2個(gè)峰對(duì)遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和大腸桿菌（Escherichia coli）均有不同程度的抑制作用，用SDSPAGE法檢測(cè)分離的2個(gè)洗脫峰，顯示有2條主蛋白帶，并以9.5 kD的蛋白含量最高。

2.2魚類體表粘液Ig的分離與提純目前魚類粘液中免疫球蛋白Ig的分離技術(shù)較為成熟，主要有柱層析法、鹽析法、離子交換層析法、疏水層析法及親和層析法等[16-17]，已分離出多種魚類的體表粘液Ig。鹽析法一般用于粗提免疫蛋白，是實(shí)驗(yàn)室最常用的方法，利用抗體與雜質(zhì)之間對(duì)鹽濃度的敏感程度差異性進(jìn)行鹽析[52]；飽和硫酸銨溶液對(duì)蛋白進(jìn)行分步沉淀，得到的Ig中有較多雜蛋白，適合在粗提前使用；凝膠過濾是利用Ig分子質(zhì)量比其他蛋白大的特點(diǎn)來分離的，是一種較為溫和的提純方法；離子交換層析根據(jù)蛋白帶電荷性的差異性進(jìn)行分離，簡(jiǎn)單易行，通常與凝膠過濾法結(jié)合使用[50]；rProteinA親和層析法提純蛋白的純度較高，但含量較低，條帶較淺，僅可用于實(shí)驗(yàn)室提取少量Ig時(shí)使用[53-54]。

魚類魚體表粘液的主要成分為蛋白質(zhì)，包括有溶菌酶、凝集素、SOD酶、抗病毒蛋白/肽、免疫蛋白Ig和溶血素等種類，是魚類先天性抗菌和抗病毒機(jī)制的重要組成成分。粘液中的多糖類成分在抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等方面有著重要意義。其中，免疫蛋白Ig在魚類的特異性免疫中有著廣闊的應(yīng)用及開發(fā)前景，純化后表現(xiàn)出多種聚合形式。Lobb等[15]從羊頭鯛體表皮膚粘液中分離出了二聚體和四聚體2種形式的Ig，并分別確定了其重鏈和輕鏈的分子質(zhì)量。目前已分離純化出歐洲鰻鱺、鯽、鱖、赤點(diǎn)石斑魚、鲇和牙鲆等魚類體表皮膚粘液Ig的重鏈和輕鏈。

3魚類體表粘液的免疫功能

3.1非特異性免疫功能當(dāng)病原體微生物入侵時(shí)非特異性免疫立即發(fā)揮作用，有效清除、降解病菌和其他有害物，此時(shí)抗體尚未產(chǎn)生[55]。魚類體表粘液對(duì)環(huán)境中細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用，主要通過抗菌蛋白/肽、凝集素、溶菌酶及補(bǔ)體等成分發(fā)揮其功能。白斑鸚哥魚的體表粘液時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種類似繭的粘液小團(tuán)，能防御外來蟲類的襲擊[7]。

魚類體表粘液中的抗菌蛋白/肽能抑制細(xì)（?。┚纳L(zhǎng)，具有良好的抑菌免疫效果，且活性強(qiáng)，其最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration， MIC）大都小于5 μg/ml，某些抗菌蛋白/肽的MIC甚至小于1 μg/ml。例如，從鯉體表粘液中分離到的27 kD蛋白對(duì)藤黃微球菌（Micrococcus luteus）的MIC為0.5 g/ml[56]；斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中分離到的15.5 kD蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的MIC在微摩爾級(jí)上，比Cecropin低約10倍，且魚類粘液中的抗菌蛋白/肽作為抑菌藥物還具有不易產(chǎn)生耐藥性、無蓄積毒性等特點(diǎn)[57]。鲇皮膚粘液抗菌肽對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌效果明顯[58]；烏鱧（Channa argus）體表粘液中同種濃度的抗菌肽對(duì)愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）有抑制作用[59]；黃斑藍(lán)子魚（Siganus oramin）皮膚粘液對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、溶藻弧菌、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）、星形卡諾氏菌等菌均有明顯的抑菌效果；且刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）和多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifliis）在與黃斑藍(lán)子魚皮膚粘液接觸過后，均出現(xiàn)纖毛脫落、蟲體腫脹、外膜破裂和內(nèi)容物泄露等現(xiàn)象[60]。

魚類體表粘液中的水解酶類是其發(fā)揮非特異性免疫的主要物質(zhì)之一[61]。體表粘液中含有豐富的溶菌酶、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）等，其酸性環(huán)境可以溶解魚類體表寄生物從而保護(hù)機(jī)體[25]。

3.2特異性免疫功能多項(xiàng)研究證明真骨魚類可能存在一套獨(dú)立的免疫系統(tǒng)——體表皮膚粘液系統(tǒng)。體表粘液能分泌出與血清類似的特異性免疫功能的組分，即在受到異物或病原體入侵時(shí)能產(chǎn)生抗體。

盡管通過SDSPAGE、瓊脂免疫擴(kuò)散和免疫電泳對(duì)鯽與8種淡水魚類血清和體表粘液蛋白分子及其抗原相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)血清和體表粘液中存在相當(dāng)數(shù)量的分子量和抗原性相同的蛋白組分[62]。但是，一些研究表明體表粘液中的免疫蛋白并非來源于血液。通過不同途徑免疫虹鱒（Oncorhynchus mykiss），利用BIAcore生物感應(yīng)器分別檢測(cè)鰓部粘液和血清中免疫蛋白的變化，結(jié)果表明前者先于后者，證明粘液中的免疫蛋白并非來自血清[63]。用創(chuàng)傷弧菌疫苗浸泡歐洲鰻鱺，發(fā)現(xiàn)其皮膚粘液的抗體滴度于第4天達(dá)到最大值，其抗體滴度達(dá)到最大值的時(shí)間明顯短于血清[13]。黃鱔的體表粘液和血清存在一定數(shù)量的分子量和抗原性相同的蛋白分子，它們蛋白分子量相同的比例達(dá)到10%～20%[64]。后續(xù)研究中成功分離出具有免疫功能的粘液免疫蛋白Ig。魚類體表粘液中的免疫蛋白Ig組分比血清中多，但其含量比魚類血清中要小，在魚類的體液免疫中有著重要的作用，且可以作為研究魚類免疫機(jī)理和魚類疾病免疫診斷的重要工具。

綜上所述，魚類體表粘液具有一定的免疫功能，對(duì)水體中的細(xì)菌等病原微生物具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)在非特異性免疫和特異性免疫方面。其非特異性免疫主要通過抗菌蛋白/肽、凝集素、溶菌酶及補(bǔ)體等發(fā)揮作用，而特異性免疫活性物主要是免疫蛋白Ig。抑菌蛋白/肽能抑制病原微生物的生長(zhǎng)，具有良好的免疫效果，且活性強(qiáng)，其大部分最低抑菌濃度MIC小于5 μg/ml，甚至小于1 μg/ml。凝集素識(shí)別異物和抗原物質(zhì)，并能協(xié)助巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞和降解作用。粘液中的水解酶類如溶菌酶、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）等，可溶解魚類體表寄生物從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。魚類體表存在一套獨(dú)立于血清的免疫系統(tǒng)——體表皮膚粘液系統(tǒng)，可分泌與血清類似的特異性免疫蛋白Ig，在魚類的特異性免疫中起著重要的作用。

42卷22期張 婷等魚類體表粘液分泌機(jī)制·組分與功能研究進(jìn)展4小結(jié)

魚類在人們的日常生活中占據(jù)重要地位，不管是在食用方面還是在觀賞方面，但是魚類疾病卻成為魚類生長(zhǎng)繁殖過程中的重大障礙。魚類體表粘液在魚類整個(gè)生命過程中至關(guān)重要，在魚類養(yǎng)殖及魚類疾病防治中的作用也得到越來越多的關(guān)注。

由于魚類體表粘液中的抗菌蛋白/肽具有良好的抑菌免疫效果，很有可能作為一種新型魚類疾病的防治的藥物，而替代傳統(tǒng)抗生素物，并可為人類疾病防治提供新的途徑，因而對(duì)其研究也較為深入。目前在魚類體表粘液的分泌機(jī)制、組分及功能上的研究已取得了一定的進(jìn)展，但體表粘液的分泌的分子生物學(xué)機(jī)制和影響因素以及分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，今后的研究應(yīng)致力于對(duì)魚類體表粘液的抗菌蛋白/肽的成分、功能及開發(fā)利用等方面，弄清魚類體表粘液的免疫機(jī)理，開發(fā)新型魚類疾病防治的藥物，為魚類疾病防治提供新方向。

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