林榮華

【摘要】目的 探討膽汁中膽汁納米細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定。方法 對(duì)40例膽結(jié)石患者膽汁標(biāo)本進(jìn)行了納米細(xì)菌培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。結(jié)果40例膽結(jié)石患者膽汁標(biāo)本納米細(xì)菌培養(yǎng)為陽(yáng)性。掃描電鏡能譜分析顯示，納米細(xì)菌外殼含有鈣、磷和鎂等元素，其鈣/磷比值為1.60。結(jié)論 膽囊結(jié)石患者膽汁中存在納米細(xì)菌感染。鈣染色對(duì)納米細(xì)菌的鑒定有重要參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】膽汁；納米；細(xì)菌；培養(yǎng)；鑒定

【中圖分類號(hào)】R-1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1671-8801（2014）10-0294-02

納米細(xì)菌是在胎牛的血清中發(fā)現(xiàn)的一種直徑在80-500nm的特殊生物微粒。納米細(xì)菌廣泛存在于生物體和礦物質(zhì)中，是一種會(huì)感染人和動(dòng)物的致病原。相關(guān)的學(xué)者已經(jīng)在國(guó)內(nèi)部分人的血清中發(fā)現(xiàn)了納米細(xì)菌，并且發(fā)現(xiàn)其的感染與年齡有關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取了本醫(yī)院中手術(shù)前無(wú)急性膽囊炎發(fā)作病史，本次住院未進(jìn)行抗菌治療，并且擬結(jié)束腹腔鏡膽囊切除的膽囊結(jié)石患者40例，男的24例，女16例，年齡在38-65歲之間。

手術(shù)前將患者的膽汁標(biāo)本統(tǒng)一留取。術(shù)中由腹腔中完整取出膽囊后，立即用無(wú)菌注射器穿刺膽囊，無(wú)菌操作抽取膽汁5ml。

1.2主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司，美國(guó)； 射線照射過(guò)的胎牛血清（ -FBS），中美合資蘭州民海生物工程有限公司，中國(guó)；鼠抗納米細(xì)菌單克隆抗體，Nanobac OY公司，芬蘭；FTTC 標(biāo)記熒光抗體，Dako Cytomation公司，丹麥。

1.3方法

1.3.1 納米細(xì)菌培養(yǎng)

將膽汁樣本通過(guò)一次性輸液器濾膜過(guò)濾2次后，依次經(jīng)0.45 m和0.22 m一次性正壓濾器過(guò)濾，將濾液0.1ml注入含DMEM培養(yǎng)液、10% -FBS和1%HEPES緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以生理鹽水替代膽汁重復(fù)上述操作作為陰性對(duì)照。每周于倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況并記錄。

1.3.2納米細(xì)菌的鑒定

間接免疫熒光染色：取含納米細(xì)菌的培養(yǎng)液16000rpm離心45分鐘，PBS洗滌沉淀，棄上清，加入無(wú)水乙醇職稱懸液，將該懸液滴置潔凈載玻片上自然晾干后置入95%乙醇和乙醚混合液（1：1）中固定15分鐘，制成納米細(xì)菌滴片，之后首先用含10%FBS（經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)不含納米細(xì)菌）的PBS封閉20分鐘，一抗（100mg/l）室溫孵育60分鐘，PBS洗滌5分鐘持續(xù)4次，二抗室溫孵育45分鐘，PBS洗滌5分鐘持續(xù)4次，雙蒸水洗滌1分鐘，50%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察，以PBS代替8D10抗體作陰性對(duì)照。

納米細(xì)菌鈣染色：制納米細(xì)菌滴片方法同上，滴加1%硝酸銀溶液覆蓋滴片，紫外線照射45分鐘。蒸餾水充分沖洗，滴加3%硫代硫酸鈉溶液覆蓋滴片，反應(yīng)5分鐘.蒸餾水充分沖洗后于普通光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果。

透射電鏡觀察：吸取含納米細(xì)菌的培養(yǎng)液，16000rpm離心45分鐘，用PBS洗滌沉淀，2.5%戊二醛4℃固定24小時(shí)，雙蒸水洗滌5分鐘，持續(xù)三次，離心后加入0.5ml雙蒸水制成混懸液。進(jìn)行負(fù)染色時(shí)，將附有碳支持膜的200目銅網(wǎng)浮于上述懸液的液滴上5分鐘，用濾紙小心吸除液體，置于10ml/L磷鎢酸懸液的液滴上90秒，用濾紙小心吸除液體、晾干，在H-7650透射電鏡下觀察，工作電壓80kV。

納米細(xì)菌超薄切片觀察：吸取含納米細(xì)菌的培養(yǎng)液同上，戊二醛4℃固定4小時(shí)，PBS沖洗，15分鐘，持續(xù)2次。1%四氧化鋨4℃固定2小時(shí)。50%、70%、90%丙酮脫水，每梯度15分鐘。100%丙酮脫水2次，每次15分鐘。丙酮和環(huán)氧樹(shù)脂一樣的數(shù)量浸透2小時(shí)，純環(huán)氧樹(shù)脂浸透2h。37℃-40℃條件下入膠囊浸透6-12h，60℃聚合24小時(shí)。用鉆石刀將納米細(xì)菌樣本切成超薄切片，5%醋酸鈾染色5分鐘，雙蒸水洗3分鐘 3次，構(gòu)椽酸鉛染色5分鐘，雙蒸水充分洗滌后干燥。在H-7650透射電鏡下觀察。

納米細(xì)菌能譜分析：吸取含納米細(xì)菌的培養(yǎng)液同上，用2.5%戊二醛4℃固定4小時(shí)，雙蒸水洗滌，加入0.5ml無(wú)水乙醇制成混懸液。在配有VANTAGE BSI型能譜儀的國(guó)產(chǎn)KYKY2800型掃描電鏡上，對(duì)其進(jìn)行能譜分析，工作電壓200KV。

2 結(jié)果

2.1 膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)

40份膽汁標(biāo)本納米細(xì)菌培養(yǎng)都是陽(yáng)性。在37℃和5%CO2的細(xì)菌培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14天，于倒置相差顯微鏡下可觀察到做不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)的細(xì)微顆粒狀物。這些細(xì)微顆粒的體積會(huì)隨著時(shí)間的推移慢慢變大，不斷增多數(shù)量，積聚成團(tuán)，并逐漸貼附于培養(yǎng)瓶底部，形成細(xì)菌集落。在第四周時(shí)，會(huì)看到更多的白色細(xì)菌顆粒集貼附在培養(yǎng)瓶底部。鏡下觀察陰性對(duì)照培養(yǎng)液，未見(jiàn)納米細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2 膽汁納米細(xì)菌的堅(jiān)定

間接免疫熒光染色。納米細(xì)菌與8DI0抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合。陰性對(duì)照為觀察到綠色熒光。

普通光鏡下觀察，納米細(xì)菌的礦化外殼被硝酸銀染成黑色，視野中布滿了黑色小顆粒。

納米細(xì)菌經(jīng)負(fù)染后于透射電鏡下觀察，其外形呈球形或短棒狀顆粒，大小約為80～350mm。超薄透片透射電鏡觀察，納米細(xì)菌中心電子密度較低，而周圍被厚厚的呈黑色電子密度較高的礦化外殼包繞。納米細(xì)菌在37℃恒溫、潮濕、5%CO2環(huán)境中，可以進(jìn)行緩慢的分裂增殖。新生成的納米細(xì)菌為50～200nm。

納米細(xì)菌能譜分析顯示，納米細(xì)菌含有鈣，磷，鎂，鋁等元素，其鈣磷比值是1.62。

3 討論

納米細(xì)菌不能用傳統(tǒng)的微生物理論看，因?yàn)轶w形微小，很難用一般的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法檢出，而且侵入生物體內(nèi)的納米細(xì)菌具有獨(dú)特的生物礦化作用，很難被徹底清除，所以，納米細(xì)菌一直是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)問(wèn)題。

我們對(duì)選取的40位患者，在無(wú)菌、厭氧條件下留取膽囊結(jié)石患者的膽囊膽汁，進(jìn)行納米細(xì)菌培養(yǎng)。

正常膽汁中存在大量的黏蛋白以及膽砂、膽固醇結(jié)晶等多種有形成分，這些成分給膽汁中分離納米細(xì)菌造成麻煩。所以，應(yīng)該探尋從復(fù)雜的膽汁中迅速提取納米細(xì)菌的方法。

本研究顯示，在膽囊結(jié)石患者的膽汁中確實(shí)存在納米細(xì)菌，由人膽汁中培養(yǎng)出的納米細(xì)菌極其微小，在普通光學(xué)顯微鏡下幾乎無(wú)法觀測(cè)，但在相差顯微鏡下卻可以比較容易的觀測(cè)到，而對(duì)其細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察則只能通過(guò)分辨率更高的電子顯微鏡才能實(shí)現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hjelle JT ，Marcia A Miller-Hjelle MA.Endotoxin and nanobacteria in polycustic disease[J].Kidney Int，2000，57：2360.

[2]Kajander EO.Nanobacteria-propagating calcifying nanoparticles[J].Letters in Applier Microbiology，2006，42：549.