欒泰龍等

摘要

[目的] 篩選適于以橡子淀粉為發(fā)酵原料的高性能優(yōu)良酵母菌種。 [方法]從幾種工業(yè)上較常用的酒精用酵母中，篩選適合于橡子淀粉質(zhì)原料發(fā)酵的菌種，對它們的發(fā)酵性能、酒精產(chǎn)量、殘?zhí)呛康确矫孢M(jìn)行分析比較。[結(jié)果]分析得出，南陽6號酵母較其他菌株的酒精產(chǎn)率高、殘還原糖低，發(fā)酵性能優(yōu)良；而蘭州L166發(fā)酵性能較高，同時耐受性好，南陽6號與蘭州L166是所選取的菌株中較適合橡子淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的菌株。[結(jié)論]在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)根據(jù)橡子原料中成分的不同對相應(yīng)菌種加以選用。

關(guān)鍵詞橡子；發(fā)酵；釀酒酵母；篩選

中圖分類號S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）36-13028-03

Abstract[Objective] To screen out high performance excellent yeast strains with acorn starch as fermentation raw material. [Method] The appropriate strains were selected from several commonly used yeasts in industry， the fermentation performance， alcohol yield and the content of residual sugar were compared. [Result] Compared with other strains， yeast of Nanyang No.6 has higher alcohol yield， lower residual reducing sugar， and excellent fermentation performance； Lanzhou L166 has higher fermentation performance and good tolerance， Nanyang No.6 and Lanzhou L166 are appropriate strains for producing ethanol by acorn starch fermentation. [Conclusion] In practical production process， appropriate strains should be selected according to composition of acorn raw material.

Key words Acorn； Fermentation； Yeast for ethanol production； Screening

燃料乙醇屬于可再生能源，是一種綠色、清潔的能源。燃料乙醇的抗爆性能良好，將其用作車用燃料能夠使燃燒更加充分， 大大降低汽車尾氣排放量， 降低對環(huán)境的污染。燃料乙醇作為替代石油能源的綠色可再生能源日益受到人們的關(guān)注。大量使用燃料乙醇除了對環(huán)境的保護(hù)益處明顯外，還降低了國家對進(jìn)口石油的依賴程度、降低能源支出在社會消費(fèi)中所占的比例等，使用燃料乙醇意義重大[1-2]。

我國櫟類資源豐富、分布區(qū)域廣泛，橡子種仁中淀粉含量高，是代替糧食作物制備生產(chǎn)燃料乙醇的理想來源[3]。燃料乙醇的生產(chǎn)目前主要采用發(fā)酵法，發(fā)酵時淀粉水解為可發(fā)酵性糖，進(jìn)而被微生物轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，在這個過程中菌株發(fā)酵性能的高低就成為了影響淀粉利用率和酒精產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。以橡子淀粉為發(fā)酵原料的菌種應(yīng)具有酒精產(chǎn)量高、淀粉利用率好、適應(yīng)性強(qiáng)、抗性好等特點(diǎn)[4]。篩選以橡子淀粉為發(fā)酵原料的優(yōu)良酵母菌種，不僅可以提高酒精發(fā)酵質(zhì)量和淀粉出酒率，而且能降低原料消耗及生產(chǎn)成本。筆者選取幾種工業(yè)上較常用的酒精用酵母，從發(fā)酵菌株的發(fā)酵性能、酒精產(chǎn)量、殘?zhí)呛考澳托缘确矫孢M(jìn)行試驗(yàn)，以期得到適于橡子發(fā)酵的高性能酵母菌種。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試菌種。黃海109、蘭州L166、天津R12、濟(jì)南Rasse12、南陽5號、6號，分別編號為XZ01～XZ06，以上酵母菌種由黑龍江省微生物研究所提供。

1.1.2

主要試劑。葡萄糖、酵母膏、氯化銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、3，5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉，苯酚、亞硫酸鈉、鹽酸、無水乙醇等，均為分析純。

1.1.3

主要儀器。XFS280A手提式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；722N可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HPX9272 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；RE 5286A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.4

培養(yǎng)基。YPD培養(yǎng)基：蛋白胨 2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，pH 6.0（固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%～2.0%），115 ℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g，酵母浸膏0.5 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO4 0.1 g， 用蒸餾水定容至100 ml，培養(yǎng)基pH用H2SO4調(diào)節(jié)至4.5，121 ℃溫度下滅菌20 min。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)選取南陽6號等6種酒精用酵母為發(fā)酵菌株，通過對發(fā)酵菌株的產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)氣量、殘?zhí)呛康确矫娴倪M(jìn)行比較，以得到適合于橡子淀粉發(fā)酵的高性能酵母菌種。

1.2.1

酵母產(chǎn)氣性能試驗(yàn)。將待試的不同酵母菌株活化好后接種至250 ml三角瓶中，接種量2%，將三角瓶置于28 ℃條件下恒溫發(fā)酵至結(jié)束。CO2失重的測定：采用直接稱重法，每經(jīng)過24 h將三角瓶稱重1次直至發(fā)酵自然停止，計算接種發(fā)酵后在單位時間內(nèi)CO2的釋放量。

1.2.2

產(chǎn)酒精能力的測定[5]。酒精含量的測定：采用比重計法。發(fā)酵結(jié)束后取100 ml發(fā)酵醪液置于500 ml蒸餾瓶內(nèi)，并加100 ml蒸餾水，加熱蒸餾直至餾出 100 ml溶液，用酒精比重計測定餾出液中的酒精度，同時測定餾出液的溫度，并換算為20 ℃時的酒精濃度。

1.2.3

殘?zhí)呛康臏y定[6]。發(fā)酵結(jié)束后取5 ml醪液過濾，將濾液稀釋至100 ml容量瓶，用DNS法測定。

1.2.4

酵母耐性試驗(yàn)。將酵母分別接入含不同乙醇濃度（0%vol、3%vol、6%vol、9%vol、12%vol）、葡萄糖濃度（100、200、300、400、500 g/L）、單寧濃度（1%、2%、3%、4%、5%）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃條件下恒溫發(fā)酵，分別測量發(fā)酵后的OD560值。

2結(jié)果與分析

2.1 酵母發(fā)酵性能結(jié)果

在發(fā)酵過程中，釀酒酵母經(jīng)過不斷利用底物原料產(chǎn)生酒精，并釋放出CO2，發(fā)酵液重量隨之減少。但是各酵母菌株的代謝能力有一定差異，對底物原料的利用程度不同，導(dǎo)致最終產(chǎn)氣量存在差別。

通過測定發(fā)酵后幾株酵母的產(chǎn)氣量，并將其記錄下來，以CO2產(chǎn)生量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，繪制CO2產(chǎn)生量曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在接種24 h內(nèi)幾種菌株都能快速地開始發(fā)酵，并且以菌株XZ02產(chǎn)氣量較多，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，各菌株的產(chǎn)氣量均有增加，尤其以24～72 h內(nèi)產(chǎn)氣量增幅最大，而在發(fā)酵72 h后CO2產(chǎn)生量逐漸下降。發(fā)酵終止時，累計發(fā)酵產(chǎn)氣量以菌株XZ02略高，而其他幾個酵母菌株與其相比，產(chǎn)氣量依次降低。

2.2酒精產(chǎn)量及殘?zhí)呛康臏y定結(jié)果

各菌株接入培養(yǎng)基后經(jīng)過發(fā)酵，試驗(yàn)結(jié)果顯示，XZ06在發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)酒精量最多，為14.2%vol，XZ04其次。對發(fā)酵液中的酒精含量進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)各菌株發(fā)酵后XZ06、XZ04的酒精含量顯著高于其他4種酵母菌（P<0.05），產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)。

殘還原糖含量低，表明發(fā)酵液中原料利用充分。通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，發(fā)酵后菌株XZ03的殘?zhí)呛孔畹停瑸?.12 g/L，XZ06其次。對發(fā)酵后的殘?zhí)呛窟M(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后XZ03、XZ06的殘?zhí)呛匡@著低于其他4種酵母菌（P<0.05），表明這2個菌株利用糖類的能力較強(qiáng)，能使發(fā)酵進(jìn)行的比較徹底。

2.3酵母耐性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1

乙醇耐性試驗(yàn)。

將活化好的酵母菌分別接入不同酒精濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，截取發(fā)酵48 h時的酵母生長情況，比較它們在不同酒精濃度條件下的生長情況，其結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，在初始發(fā)酵液中酒精濃度為0%vol～6%vol的條件下，發(fā)酵48 h后幾種酵母的吸光度值逐漸下降，其中以XZ05、XZ06下降速率較快，XZ01、XZ02 2個菌株下降較平穩(wěn)。當(dāng)在初始發(fā)酵液中酒精濃度達(dá)到6%vol～12%vol的條件時，經(jīng)過48 h發(fā)酵，6種菌株的吸光度值下降均較快，說明在較高酒精濃度條件下，各菌種的酒精耐受能力下降較大，但最終以XZ01、XZ02的吸光度值略高。從各種酵母菌株的酒精耐受比較結(jié)果可以看出，XZ01、XZ02比其他酵母菌株具有更強(qiáng)的耐受酒精能力。

2.3.2

糖濃度耐性試驗(yàn)。

將活化好的酵母菌分別接入不同葡萄糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，測定發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)24 h發(fā)酵后的吸光度值，比較各菌株在不同葡萄糖濃度條件下菌體的生長情況。通過圖4顯示出，當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度在100～200 g/L時，經(jīng)過一段時間的發(fā)酵培養(yǎng)，各酵母菌株發(fā)酵液的吸光度均較大。隨后隨著糖濃度的增大，各菌株的吸光度均減小，說明發(fā)酵液中的糖濃度含量在100～200 g/L時更適合這幾種酵母菌株的生長。當(dāng)糖濃度升高到500 g/L時，各酵母生長都趨于緩慢，同時XZ01～XZ04吸光度接近，但高于XZ05、XZ06。

發(fā)酵結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度較低時，幾種菌株發(fā)酵狀況良好，當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度較高時，XZ05、XZ06的糖耐受性低于其他菌株。初始的發(fā)酵糖濃度對酵母菌生長存在一定的影響，因此，在以橡子淀粉為發(fā)酵原料的培養(yǎng)基中應(yīng)根據(jù)淀粉水解程度選擇適合于發(fā)酵的酵母菌。

2.3.3

單寧濃度試驗(yàn)。

各酵母菌種在含不同濃度單寧的培養(yǎng)基中經(jīng)過24 h發(fā)酵，其結(jié)果如圖5。從圖5中可以看出，發(fā)酵過程隨單寧濃度的升高整體呈下降趨勢。XZ01、XZ03 2個菌株在各個濃度下均生長緩慢，XZ04在1%～2%單寧濃度范圍內(nèi)吸光度值下降較快，表示這3個菌株在低單寧濃度時即受到較大抑制，其他3個菌株在各濃度條件下吸光度值下降均勻，其中XZ02的吸光度值相對較高，在5%單寧濃度條件下XZ06吸光度最大，

3 結(jié)論

橡子中淀粉含量高，是潛在的重要淀粉質(zhì)原料來源，以橡實(shí)淀粉為原料制備燃料乙醇具有良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過上述試驗(yàn)結(jié)果，分別從酒精產(chǎn)率和菌株耐性等方面綜合考慮，南陽6號較其他菌株的酒精產(chǎn)率高、殘還原糖低，發(fā)酵性能優(yōu)良；而蘭州L166發(fā)酵性能較高，同時耐受性好，南陽6號與蘭州L166是所選取的菌株中較適合橡子淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的菌株。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)根據(jù)橡子原料中成分的不同對相應(yīng)菌種加以選用。

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