查玉兵等

摘要[目的]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LCMS/MS），在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下建立了四大南藥中黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）含量的測(cè)定方法。[方法]試樣中的黃曲霉毒素經(jīng)甲醇/水（70/30）提取，黃曲霉毒素免疫親和柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量。[結(jié)果]該方法的檢出限（LOD）為0.2～0.5 μg/kg，線性范圍為0～50 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999；在2～50 μg/kg的添加水平上，4種霉菌毒素平均回收率為78.6%～92.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.8%～8.4%。[結(jié)論]該方法前處理簡(jiǎn)單、快速，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高。

關(guān)鍵詞高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；黃曲霉毒素；四大南藥；含量

中圖分類(lèi)號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-12901-03

Abstract[Objective] The research aimed to develop the determination method of aflatoxin （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）content in four south medicines in the multiple reaction monitoring （MRM） mode by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS）. [Method]The drugs were extracted with methanol/water（70/30，V/V），and cleaned up by using beacon aflatoxin column，dissolved in methanol and analysised by LCMS/MS.[Result]The limits of detection（LOD） were 0.2-0.5 μg/kg.The calibration curves were linear between 0 to 50 μg/L，and the correlation coefficient was more than 0.999.The average recoveries ranged from 78.6%-92.1% and RSD was 0.8%-8.4% by addition of 2-50 μg/kg avermectin standards to four south medicines as matrixes. [Conclusion] The proposed method was fast， simple， sensitive and accurate.

Key wordsUPLCMS/MS；Aflatoxin；Four south medicines；Contaminants

檳榔、益智、砂仁、巴戟天為海南盛產(chǎn)的我國(guó)四大南藥，檳榔用于驅(qū)蟲(chóng)清積、引氣利尿，益智能溫脾暖胃、固本澀精，砂仁是引氣和中、開(kāi)胃消食、止痛安胎之良藥，巴戟天則能補(bǔ)氣益精、強(qiáng)筋壯骨、祛風(fēng)除濕。目前，四大南藥在臨床上應(yīng)用十分廣泛[1]。然而，藥材在生產(chǎn)、加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，由于條件和技術(shù)簡(jiǎn)陋，很容易發(fā)生霉變而產(chǎn)生黃曲霉毒素（AFT）。

黃曲霉毒素發(fā)現(xiàn)于1960 年，毒性為氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍。AFT可引起肝臟的急慢性損害，同時(shí)還對(duì)腎臟等其他多種組織器官造成嚴(yán)重?fù)p害，且具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致” 作用[2]。韓國(guó)食品醫(yī)藥品安全廳（KFDA）發(fā)布了有關(guān)中藥材中黃曲霉毒素B1限量標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn)方法的公告，要求甘草、決明子、桃仁等9味中藥材黃曲霉毒素B1低于10 μg/kg[3] 。泰國(guó)允許黃曲霉毒素B1的限量20 μg/kg[4]，我國(guó)原外經(jīng)貿(mào)部WM2-2001《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[5]中AFT 限量標(biāo)準(zhǔn)為小于5 μg/kg?！吨袊?guó)藥典》2010版一部?jī)H對(duì)桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規(guī)定AFB1最高限量5 μg/kg，AF（B1+B2+G1+G2）最高限量為10 μg/kg。目前，黃曲霉毒素的測(cè)定方法主要有薄層色譜法（TLC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7]、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）[8]以及生物傳感器法等。但由于無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題，不能作為最終的確證方法。筆者采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定四大南藥中黃曲霉毒素含量，不僅簡(jiǎn)化了前處理步驟，且大大提高了方法的檢出限。

1材料與方法

1.1儀器

Waters ACQUITY UPLCTMTQD MS/MS系統(tǒng)（美國(guó)waters）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R205（瑞士BUCHI公司）；超聲波清洗器（德國(guó)ELMA公司）；渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；MilliQ純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2試劑乙腈（色譜純）；甲醇（分析純）；甲酸（色譜純）；乙酸（色譜純）；乙酸銨（色譜純）；乙酸乙酯（分析純）；水為二次蒸餾水；黃曲霉毒素免疫親和柱（柱容量約300 ng 黃曲霉毒素，3 ml）；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置稱(chēng)取適量黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解于25 ml容量瓶中，配成100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)根據(jù)需要以流動(dòng)相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別吸取適量?jī)?chǔ)備溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液）于同一容量瓶中，用甲醇配制成1.0 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃保存。吸取適量上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.4黃曲霉毒素的提取

稱(chēng)取5.0 g樣品于50 ml 離心管中，加入1 g氯化鈉及50 ml 甲醇-水（70∶30，V/V）高速勻漿1 min，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，取20 ml上濾液加入10 ml水，搖勻，備用。

1.5提取物的凈化

精密吸取濾液15 ml，通過(guò)免疫親合柱（1～2滴/秒），棄去流出液，用10 ml水分2次洗脫，棄去洗脫液，抽干，再用2.0 ml甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。過(guò)0.2 μm濾膜，供LCMS/MS測(cè)定。

1.6色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；流動(dòng)相為乙腈（A）/ 0.1甲酸水溶液（V/V）。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，90%A；1.0～2.2 min，90%～50%A；2.2～3.0 min，50%～90%A；3～4 min，90%A保持1 min。流速為0.2 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μl。離子源為ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓4.0 kV；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量800 L/ hr；錐孔反吹氣流量50 L/hr；錐孔電壓40 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。用于定性、定量的離子對(duì)和相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇

在試驗(yàn)過(guò)程中，提溶劑的選擇直接影響方法的準(zhǔn)確度。黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，該試驗(yàn)分別選用甲醇、乙腈、水、甲醇/水和乙腈/水作為萃取溶劑。試驗(yàn)證明，用甲醇/水體系比其他溶劑的提取回收率高，比較了甲醇/水在70/30、80/20和90/10時(shí)的添加回收率，當(dāng)甲醇/水為70/30時(shí)，4種黃曲霉毒素的回收率最高。所以選取了70/30甲醇/水作為提取溶劑。

2.2液相色譜及質(zhì)譜條件的選擇

用乙腈作為有機(jī)相，在流動(dòng)相中分別加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mM乙酸銨，結(jié)果表明乙腈和0.1%甲酸水溶液作梯度洗脫時(shí)，能夠獲得最強(qiáng)的離子豐度，所以最終確定乙腈和0.1%甲酸為流動(dòng)相。試驗(yàn)中嘗試了分別采用正、負(fù)2種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效率明顯高于負(fù)離子模式。通過(guò)全離子掃描（ Full scan）確定4種黃曲霉毒素的選擇離子，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖如圖1所示。

2.4實(shí)際樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)采購(gòu)了檳榔、益智、砂仁、巴戟天4種南藥，每種采購(gòu)3 批，然后按照上述方法測(cè)定樣品中黃曲霉毒素的含量。結(jié)果表明，益智中的黃曲霉毒素含量最高，且所有益智樣品中4種黃曲霉毒素的陽(yáng)性率均為100%，其中AFB1含量最高的為0.81 μg/kg，遠(yuǎn)低于《中國(guó)藥典》2010版一部?jī)H對(duì)桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規(guī)定AFB1 最高限量5 μg/kg，而4種黃曲霉毒素總量最高的為10.3 μg/kg，稍高于《中國(guó)藥典》2010版一部?jī)H對(duì)桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規(guī)定AF（B1+B2+G1+G2）最高限量10 μg/kg。檳榔樣品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的陽(yáng)性率分別為80%、60%、20%和20%，其中AFB1和AFB2含量最高的分別為1.83和1.44 μg/kg，4種黃曲霉毒素總量最高達(dá)856 μg/kg。巴戟天中樣品AFB1和AFB2的陽(yáng)性率均為20%，總量最高為2.01 μg/kg。砂仁樣品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的陽(yáng)性率均為20%，總量最高為0.56 μg/kg。

3結(jié)論

藥材在生產(chǎn)、加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，容易發(fā)生霉變而產(chǎn)生黃曲霉毒素。我國(guó)對(duì)外貿(mào)易合作部發(fā)布的藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（2001年第4號(hào)文）規(guī)定部分藥材中黃曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg；香港特區(qū)政府衛(wèi)生署公布的中藥材參考標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定黃曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg，總量≤10 μg/kg；歐洲藥典（EP 6.2）規(guī)定黃曲霉毒素AFB1≤2 μg/kg，總量≤4 μg/kg。按照韓國(guó)新的許可標(biāo)準(zhǔn)，中藥材中黃曲霉毒素AFB1的含量必須低于10 μg/kg。該項(xiàng)目所建立的四大南藥中黃曲霉毒素分析方法，該方法的檢出限（LOD）為0.2～0.5 μg/kg，完全滿足各國(guó)規(guī)定的藥材中黃曲霉毒素的限量要求；線性范圍為0～50 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2均大于0999。在2～50 μg/kg的添加水平上，4種霉菌毒素平均回收率為78.6%～92.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.8%～84%。利用該方法對(duì)四大南藥樣品進(jìn)行了分析，樣品中黃曲霉毒素AFB1均未超標(biāo)，但部分藥材中黃曲霉毒素總量有超出歐洲藥典的限量標(biāo)準(zhǔn)。建議有關(guān)部門(mén)盡快制定我國(guó)藥材中黃曲霉毒素AFB1以及總量的限量標(biāo)準(zhǔn)，以加強(qiáng)對(duì)藥材的管理。

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