吳劍等

摘 要：目的：探討PYGM基因SNP及單體型多態(tài)性與女子長跑運動員生理表型的關聯(lián)性。方法：研究對象為我國備戰(zhàn)2012年倫敦奧運會國家集訓隊的79名女子長跑運動員。對PYGM基因的rs483962、rs490980和rs589691 3個位點進行基因型和單體型分析；并研究基因型和單體型與各生理表型指標的關聯(lián)性。結(jié)果：1）rs490980位點不同基因型與運動員O2AT/W顯著相關（P<0.05），CC型顯著性低于TT型和TC型；rs589691位點不同基因型與運動員WHR顯著相關，CC型顯著性低于TC型和TT型；2）由rs490980-rs589691位點組成的單體型與WHR顯著性相關，TT單體型攜帶者WHR顯著性高于非TT單體型攜帶者。結(jié)論：1）PYGM基因rs490980位點可以作為與有氧運動能力表型有關聯(lián)性的基因標記； 2）PYGM基因rs589691位點和rs490980-rs589691位點組成的單體型可以作為與身體成分有關聯(lián)性的基因標記。

關鍵詞： PYGM基因；SNP；單體型；生理表型；關聯(lián)性研究

中圖分類號： G 804.2 文章編號：1009-783X（2014）04-0376-04 文獻標志碼： A

Abstract：Objective：To explore the association of polymorphisms in PYGM gene with the physiological phenotypes of female long-distance athletes.Methods：We examined the genotypes and haplotypes in SNPs （rs483962，rs490980 and rs589691） of PYGM gene，and used one-way analysis of variance to find the association between the polymorphisms and physiological phenotypes in 79 female long-distance athletes who were preparing for London Olympic Games.Results：The individuals with rs490980-CC genotype had lower O2AT/W than TT and TC.The rs589691 was associated with WHR，those carried CC genotype had lower WHR.The rs490980-rs589691 haplotype was associated with WHR，the individuals with TT haplotype had higher WHR than others.Conclusion：rs490980 may serve as molecular marker associated with aerobic endurance capability phenotypes.rs589691 and rs490980-rs589691 haplotype were associated with body composition phenotypes.

Keywords：PYGM gene； SNP； haplotype； physiological phenotypes； association study

糖原是能量的主要儲備形式。糖原磷酸化酶（GP）是糖原代謝過程中的限速酶，使糖原分解釋放出1-磷酸葡萄糖（G-1-P）。人類糖原磷酸化酶從20世紀30年代開始一直被研究者重視，根據(jù)其功能、結(jié)構(gòu)及組織分布特性主要分為3種亞型，即肌型（Muscle-type GP，PYGM）、肝型（Liver-type GP，PYGL）與腦型（Brain-type GP，BGP或PYGB）[1-3]。肌肉中僅存在M型磷酸化酶，為肌肉收縮提供能量，稱為肌肉磷酸化酶（PYGM），而其他組織中含有2種以上的同工酶[4]。肌肉磷酸化酶的主要作用為水解肌糖原支鏈的α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)物為1-磷酸葡萄糖，后者轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，進一步生成丙酮酸。有氧代謝時，丙酮酸進入線粒體生成乙酰輔酶A，再通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）；而無氧酵解時，丙酮酸則生成乳酸和少量ATP[5]。

PYGM基因位于染色體11q12-13.2，由2523個堿基對組成，分為20個內(nèi)含子和12個外顯子[6]。該基因的遺傳性缺失可引發(fā)一種典型的代謝性肌病—McArdle病，該病的特征為20～30歲起病，表現(xiàn)為運動不耐受、疲勞、肌痛及運動時肌肉痙攣，有時有反復發(fā)作的肌紅蛋白尿，由此推測其基因多態(tài)性可能與運動能力有一定的關聯(lián)性。

PYGM在肌肉能量代謝中有重要作用，但迄今尚未見其與優(yōu)秀有氧運動能力表型相關的報道。研究選擇優(yōu)秀長跑運動員作為研究對象，根據(jù)以往研究報道及在中國人群中的分布頻率，選擇位于基因5′端非編碼區(qū)啟動子區(qū)域的rs483962和第4、5內(nèi)含子內(nèi)的rs490980、rs589691 3個單核苷酸多態(tài)位點（single nucleotide polymorphism，SNP）進行基因型分析。這3個位點是位于不同的單體型區(qū)塊的tagSNP（標簽SNP），可以代表不同單體型區(qū)塊的信息；然后根據(jù)PYGM的功能，對研究對象的相關生理表型指標進行測試，以期尋找PYGM基因多態(tài)性與優(yōu)秀有氧運動能力表型的相關性。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

我國備戰(zhàn)2012年倫敦奧運會國家集訓隊的女子長跑運動員79名，分別來自山東、河北、河南、內(nèi)蒙古和北京共5個省市區(qū)專業(yè)隊， 北京體育大學和北京航空航天大學長跑隊，北京遠中田徑俱樂部女子長跑隊。研究對象總?cè)藬?shù)占2010年我國長跑項目注冊運動員總?cè)藬?shù)的83%，集中了我國目前女子長跑項目成年與青年運動員群體。2010年全國田徑錦標賽上獲取長跑各單項前8名的運動員中有92%被納入本研究，基本覆蓋了長跑項目全部優(yōu)秀運動員，運動員基本情況見表1。

2.2 研究方法

2.2.1 表型指標的測定

按照指標所反映的功能，共分為以下2類，采集方法略。

有氧運動能力相關指標：無氧閾攝氧量（O2AT）、相對無氧閾速度（O2AT/W）、無氧閾心率（HRAT）、無氧閾速度（VAT）、最大攝氧量（O2max）、相對最大攝氧量（O2max/W）、無氧閾攝氧量/最大攝氧量（O2AT/O2max）、最大心率（HRmax）、最大跑速（VO2max）；

身體成分相關指標：體脂百分比、身高/體質(zhì)量百分比、托克來指數(shù)、體格指數(shù)、體重指數(shù)、腰臀比、皮褶厚度總和、肱三頭肌處皮褶、肩胛下角處皮褶、腹部皮褶、髂嵴處皮褶、小腿三頭肌處皮褶。

2.2.2 基因多態(tài)性分析

取5 mL受試者靜脈血，收集于抗凝管；Promaga公司基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；保存于-70 ℃環(huán)境中。

采用基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時間質(zhì)譜技術（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI- TOFMS）對SNP位點進行基因解析。PCR引物和單堿基延伸引物由Assay Designer（Sequenom）軟件包設計。所有需要分型的DNA 樣本都稀釋到5 ng/μL。取1 μL DNA樣本，將其與0.95 μL水、0.625 μL PCR緩沖液（含MgCl2 15 mmol/L）、1 μL的dNTP 2.5 mmol/L、0.325 μL的MgCl2 25 mmol/L、1 μL PCR引物及0.1 μL HotStar Taq酶（Qiagen）混合在一起。PCR 反應條件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)；最終72 ℃ 3 min。PCR擴增后，剩余的dNTP將被去磷酸消化掉，反應體系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3U堿性磷酸酶（Sequenom）。該反應在37 ℃進行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活。堿性磷酸酶處理后，針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應體系中進行：0.755 μL水、0.2 μL 10X iPLEX緩沖液、0.2 μL終止混合物、0.041 μL iPLEX酶 （Sequenom），0.804 μL 10 μ mmol/L 的延伸引物。單堿基延伸反應在下列條件下進行：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5個循環(huán)，共40個循環(huán)；最后72 ℃ 3 min。在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂（Sequenom）脫鹽，混合后加入25 μL水懸浮。使用MassARRAY Nanodispenser （Sequenom） 將最終的分型產(chǎn)物點樣到一塊384孔的spectroCHIP （Sequenom）上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行分析。最終結(jié)果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)實時讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)完成基因分型分析。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

Shesis在線軟件對各多態(tài)位點進行哈溫平衡檢驗。單個SNP位點不同基因型之間各生理表型指標的差異以表型指標為變量進行單因素方差分析。統(tǒng)計分析由SPSS軟件完成，顯著性水平定為P<0.05。

Shesis在線軟件計算同一基因不同位點間的D′和r2，以度量對應位點間的LD緊密程度，并計算單體型頻率。多個位點的單體型分析采用R-平臺下的haplo.stat軟件。以生理表型指標為變量進行單因素方差分析，統(tǒng)計分析不同單體型與各指標的關聯(lián)性，統(tǒng)計分析由SPSS軟件完成，顯著性水平定為P<0.05。人數(shù)過低的單體型與相近單體型組進行合并，3種以下單體型的統(tǒng)計分析使用獨立樣本t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 PYGM基因單個位點多態(tài)性與生理指標的關聯(lián)性

分析PYGM基因3個多態(tài)位點不同基因型與有氧運動能力指標的關聯(lián)性，結(jié)果顯示：rs490980位點不同基因型與運動員O2AT/W顯著相關，CC型顯著性低于TT型和TC型；rs589691位點不同基因型與運動員WHR顯著相關， CC型顯著性低于TC型和TT型，見表2。

4 討論

4.1 PYGM基因與有氧運動能力相關指標的相關性

研究結(jié)果顯示：PYGM基因rs490980位點不同基因型與運動員O2AT/W顯著相關，CC型顯著性低于TT型和TC型。

運動員的生理機能一直是長跑項目研究的核心問題，其中有氧運動能力中的O2max、AT和RE被認為是決定運動成績的3大主要因素[7]。目前大多數(shù)研究者認為，運動員有氧耐力的提高并不完全是O2max增長的結(jié)果，和AT的提高有密切關系，甚至后者關系更大。有人發(fā)現(xiàn)，有氧耐力好的運動員，AT出現(xiàn)得晚。如速度性運動員AT值為50%～60%O2max，而耐力運動員AT值則可為80%～90%O2max[8]。本實驗室前期的研究的測試結(jié)果頁顯示：優(yōu)秀運動員在AT和O2max水平下的多項指標均顯著優(yōu)于一般運動員，與馮美云對2004年奧運會國家集訓隊的研究結(jié)果相一致，證明O2AT能夠準確和真實地反映運動員的機能水平。

PYGM是糖原代謝過程中的限速酶，其表達降低會造成糖原代謝障礙，從而影響運動能力。由于未見到國內(nèi)外對rs490980位點基因型與有氧運動能力表型的相關研究，因此，無法確認其對表型的具體影響。分析認為，該位點位于PYGM基因Intron4位置，內(nèi)含子為非編碼蛋白的序列。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子是基因組中的一種重要元件，對內(nèi)含子的功能提出了許多新的見解：內(nèi)含子在維持染色體的特定結(jié)構(gòu)、基因的特定功能方面有重要作用；內(nèi)含子在進化過程中通過“外顯子改組”的作用在基因的進化中起作用；內(nèi)含子還對基因的表達起調(diào)控作用[9]。本研究認為，rs490980位點多態(tài)性可能對PYGM mRNA的表達有一定影響，從而影響了代謝過程，產(chǎn)生了不同基因型O2AT/W的差異性。

4.2 PYGM基因與身體成分相關指標的關聯(lián)性

研究結(jié)果顯示：PYGM基因rs589691位點不同基因型與運動員WHR顯著相關，CC型顯著性低于TT型和TC型；單體型方面，PYGM基因2-3位點單體型與運動員WHR顯著相關，TT單體型個體顯著性低于非TT單體型個體。

腰臀比（WHR）是腰圍和臀圍的比值，是判定中心性肥胖的重要指標。腰臀比可作為獨立客觀反映身體脂肪分布特征的體成分指標：腰臀比越大，體重越大，腹部皮褶越厚；腰臀比增大其血壓升高趨勢顯著，心肺功能也越差；腰臀比增大能使力量、柔韌性、平衡能力、靈敏和反應能力下降[10]。

人體的運動需要能量，機體的新陳代謝過程中，同樣也需要能量。細胞代謝直接利用能源來自于ATP的分解產(chǎn)生，ATP的合成需要的能量最終主要是由糖的分解代謝提供。運動中血糖濃度保持相對恒定，隨著運動強度的增加，血糖產(chǎn)生與血糖的利用呈平行性變化。運動中肌糖原的分解調(diào)節(jié)，主要是肌肉收縮，肌細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，Ca2+可以激活磷酸化酶b激酶而提高糖原磷酸化酶的活性，其次是激素尤其是腎上腺素，通過與肌細胞膜的a受體結(jié)合，使細胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷增加，經(jīng)過一系列的化學變化，導致糖原磷酸化酶的活性升高，促進糖原的分解；因此，PYGM對于機體的糖代謝有重要作用，其活性直接影響集體的新陳代謝過程。

在人類基因組中，相鄰近的SNPs等位基因并不是隨機組合的，而是傾向于以一個整體遺傳給后代，染色體上一系列緊密連鎖并共同遺傳的遺傳標記稱為單體型（haplotype）[11-12] 。如果一個單體型有n個變異位點，理論上就可能有2n種可能的單體型；但實際上，大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個常見的單體型，它們的模式變化較少且有種族特異性，并且同種族個體中有80%～90%的單體型是一致的，因此，代表了一個群體中的大部分多態(tài)性。由于單體型內(nèi)部緊密連鎖且變化較少，因此，可以通過tagSNP代表絕大多數(shù)常見的單體型，從而大大降低了SNP分析的數(shù)量[13]。

應用tagSNPs構(gòu)建單體型可以有效地覆蓋影響表型的常見單體型。復雜表型一般與多個位點的變異有關，同一個基因上特定等位基因的不同組合對蛋白合成轉(zhuǎn)錄水平有不同的影響，因此，單體型分析十分重要。單體型和連鎖不平衡分析的方法在醫(yī)學領域遺傳疾病的相關研究中已經(jīng)被大量應用，在運動分子生物學的研究中也在逐步被引入。本文選擇的位于基因第4、5內(nèi)含子內(nèi)的rs490980、rs589691 2個位點，是位于不同的單體型區(qū)塊的tagSNP，可以比較好的代表該區(qū)域的分子遺傳特征。

研究表明：存在于基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的基因多態(tài)位點，可以從功能上直接影響相關基因的表達，也可以與真正的影響功能的基因處于連鎖狀態(tài)，成為有效的分子標記。由于編碼區(qū)的突變常常會引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，因此，位于編碼區(qū)非同義突變的多態(tài)位點相對較少，而位于非編碼區(qū)的多態(tài)性在基因的表達中起重要調(diào)控作用。rs589691位于PYGM基因Intron5，rs490980-rs589691單體型的2個組成位點也均位于PYGM基因的內(nèi)含子位置，屬于基因的非編碼區(qū)。由此分析上述幾個位點可能對基因表達有一定的調(diào)控作用，從而影響了PYGM的功能和活性，與身體的能量代謝有一定的關聯(lián)性；但上述位點的生物學功能和對PYGM基因表達影響的具體機制，還需應用誘導蛋白表達等方法進一步進行研究。

5 結(jié)論

PYGM基因rs490980位點CC基因型顯著性低于TT型和TC型，可以作為有氧運動能力表型有關聯(lián)性的基因標記。

PYGM基因rs589691位點CC基因型的WHR顯著性低于TT型和TC型；rs490980-rs589691位點TT單體型個體的WHR顯著性低于非TT單體型個體，該基因型和單體型可以作為與身體成分有關聯(lián)性的基因標記。

參考文獻：

[1]Man-Fung Yuen，Pui-Chee Wu，Vicky Ching-Har Lai，et al.Expression of c-Myc，c-Fos，and c-jun in hepatocellular carcinoma[J].Cancer，2001，91：106-12.

[2]Chung Y H，et al.Expression of transforming growth factor-alpha mRNA in livers of patients with chronic viral hepatitis and hepatocellular carcinoma [J].Cancer，2000，89：977-982.

[3]Narayanan Gopalakrishna Iyer1，Hilal O zdag，Carlos Caldas.p300/CBP and cancer[J].Oncogene，2004，23：4225-4231.

[4]Dimaur S，Andreu A L，Bruno C，et al.Myophosphorylase deficiency （glycogenosis type V； McArdle disease）[J].Curr Mol Med，2002，2：189-196.

[5]Roach R J.Glycogen and its metabolism[J].Curr Mol Med，2002，2：101-120.

[6]Kubisch C，Wicklein E M，Jentsch T J，et al.Molecular diagnosis of McArdle disease：revised genomic structure of the myophosphorylase gene and identification of a novel mutation [J].Hum Mutat，1998，12：27-32.

[7]Lucia A，Oliván J，Bravo J，et al.The key to top-level endurance running performance：a unique example [J].Br J Sports Med.2008，42（3）：172-4.

[8]宋旭敏.關于機體在運動中的最大攝氧量和無氧閾的研究[J].河北體育學院學報，2002，14（2）：97-99.

[9]丁紅梅，邵根寶，徐銀學.內(nèi)含子與基因表達調(diào)控[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（3）：50-52.

[10]孫飆，姜文凱，湯強，等.成人腰臀比與某些形態(tài)、機能和素質(zhì)間的相關分析[J].體育與科學，2002，23（6）：56-63.

[11]李婧，潘玉春，李亦學，等.人類基因組單核苷酸多態(tài)性和單體型的分析及應用[J].遺傳學報，2005，32（8）：879-889.

[12]耿茜，蔣緯瑩.人類基因組單體型圖計劃及其意義[J].國外醫(yī)學遺傳學分冊，2005，28（1）：1-5.

[13]何子紅，胡揚.運動能力相關基因標記的研究策略及方法[J].中國運動醫(yī)學雜志，2006，25（16）：684-691.