閻曉菲等

摘要[目的] 尋找雞球蟲保護(hù)性抗原基因，為研究基因功能和研制抗雞球蟲疫苗奠定基礎(chǔ)。[方法] 將純化的堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊于兔皮內(nèi)多點(diǎn)注射，制備堆型艾美耳球蟲抗血清，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)其效價(jià)，進(jìn)行免疫學(xué)篩選。利用PCR對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行初步鑒定。[結(jié)果] 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果表明堆型艾美耳球蟲抗血清檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，初步篩選到的疑似陽(yáng)性斑經(jīng)3次復(fù)篩后獲得6個(gè)陽(yáng)性克隆，1～3號(hào)克隆約為1 000 bp，4～6號(hào)克隆約為1 500 bp。[結(jié)論]對(duì)堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫(kù)獲得的陽(yáng)性克隆成功進(jìn)行了免疫學(xué)篩選。

關(guān)鍵詞雞；球蟲；堆型艾美耳球蟲；cDNA文庫(kù)；免疫學(xué)篩選

中圖分類號(hào)S821文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）14-04363-02

Immunological Screening of cDNA Expression Libraries in Sporulated Oocysts of Eimeria acervulina

YAN Xiaofei et al（Science and Technology School of Xinjiang Agricultural University， Xinjiang， Urumqi 830052）

Abstract[Objective] The research aimed to find out the protective antigen gene of chicken coccidian and lay the foundation for studying the gene function and producing vaccine against chicken coccidiosis. [Method] The purified sporulated oocysts of Eimeria acervulina was injected in many points of rabbit skins to prepare the antiserum of E. acervulina. And its titer was detected by ELISA to make immunological screening. And the obtained positive clone was identified by PCR. [Result] The results of ELISA showed that the antiserum detection results of E. acervulina was positive. After preliminary screening， suspected positive plaques were obtained， then 6 positive clones were obtained after three times of second screening. The size of 1-3 clone were about 1 000 bp and that of 4-6 clone were about 1 500 bp. [Conclusion] The immunological screening of the positive clones obtained from cDNA library of sporulated oocysts of E. acervulina was made.

Key wordsChicken； Coccidia； Eimeria acervulina； cDNA library； Immunological screening

雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于雞腸道所引起的一種危害極其嚴(yán)重的全球性寄生蟲病，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于雞球蟲病的嚴(yán)重危害，如何對(duì)其有效預(yù)防成為廣大生產(chǎn)者及科研工作者廣為關(guān)注的問(wèn)題。目前防治雞球蟲病主要有2種方法：藥物預(yù)防和疫苗預(yù)防。由于藥物防治球蟲病存在嚴(yán)重的抗藥性、且藥物的研制周期長(zhǎng)、費(fèi)用高以及藥物殘留造成的環(huán)境污染等問(wèn)題的存在，對(duì)雞球蟲病的防治越來(lái)越趨向于疫苗防治。活卵囊疫苗雖然已經(jīng)在國(guó)外上市，但由于免疫效果和安全性問(wèn)題，并未得到廣泛推廣使用，因此必須采取新的措施防制雞球蟲病[1]。目前，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)建的基因工程疫苗已被證實(shí)可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生長(zhǎng)期的體液免疫和細(xì)胞免疫，抵抗包括球蟲病在內(nèi)的多種疾病，因此成為疫苗發(fā)展的新方向[2]。

目前已克隆出一些雞球蟲保護(hù)性抗原基因，主要是通過(guò)構(gòu)建表達(dá)性DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，再用各種抗體或探針篩選保護(hù)性抗原基因。從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選目的基因的方法較多，其中以抗血清為探針篩選目的克隆是獲取未知基因靈敏可靠的方法。構(gòu)建于表達(dá)載體中的cDNA文庫(kù)可利用特異性抗體進(jìn)行篩選，即將含文庫(kù)的各培養(yǎng)皿上的菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，各種cDNA表達(dá)的蛋白質(zhì)便牢固地結(jié)合在膜上，然后將膜放入特異性抗體的溶液中進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，洗掉未結(jié)合的抗體后，再與HRP標(biāo)記的第2抗體結(jié)合，通過(guò)相應(yīng)底物顯色，進(jìn)而找出對(duì)應(yīng)于原文庫(kù)培養(yǎng)皿中的菌落，篩選出目的cDNA克隆[3-5]。筆者對(duì)建立的雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）孢子化卵囊cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，以尋找保護(hù)性抗原基因，為研究基因功能和研制抗球蟲疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。新西蘭大白兔，健康，雄性，體重約2 kg，購(gòu)自上海松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)。

1.1.2主要試劑。E.acervulina cDNA文庫(kù)由上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。該文庫(kù)構(gòu)建于λTriplEx2噬菌體XL1blue大腸桿菌系統(tǒng)中，基礎(chǔ)庫(kù)容量為4.7×106 pfu/ml，擴(kuò)增后文庫(kù)的滴度為4.4×1010 pfu/ml；XL1blue、BM25.8大腸桿菌、引物：5′端引物：5′TCCGAGATCTGGACGAGC3′；3′端引物：5′TAATACGACTCACTATAGGG3′，由SMARTTM cDNA Library Construction Kit附帶，購(gòu)自Clontech公司。

1.1.3主要儀器。電熱恒溫水浴鍋，由上海一恒科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)DK80；隔水式電熱培養(yǎng)箱，由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)，型號(hào)GSP9050MEB；托盤天平，由上海醫(yī)療器械八廠生產(chǎn)，型號(hào)BPⅡ；超聲破碎儀、核酸蛋白測(cè)定儀，由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1E.acervulina抗血清的制備。用pH7.6 PBS將純化的E.acervulina孢子化卵囊調(diào)整到2×107個(gè)/ml，于-70和38 ℃下反復(fù)凍融5次，冰浴條件超聲裂解卵囊20 min，10 000 r/min離心30 min，收集上清液作為E.acervulina可溶性抗原。用弗氏完全佐劑和E.acervulina可溶性抗原按1∶1的比例完全乳化，于兔皮內(nèi)多點(diǎn)注射，進(jìn)行一免，蛋白劑量共為3 mg；2周后二免，劑量為共3.5 mg，佐劑為弗氏不完全佐劑，皮內(nèi)注射；二免后2周進(jìn)行三免，直接皮內(nèi)注射E.acervulina可溶性抗原8 mg。三免2周后采血，按照常規(guī)方法分離血清，將收集到的血清-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2E.acervulina cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選。用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)E.acervulina抗血清的效價(jià)。利用大腸桿菌裂解液對(duì)抗血清進(jìn)行預(yù)吸收，以去除大腸桿菌抗體。免疫學(xué)篩選方法參考有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]并作適當(dāng)修改。取1.5 ml無(wú)菌離心管，加入2 μl 1∶10 000稀釋的cDNA文庫(kù)（每塊90 mm的平板所形成的噬菌斑≤600）及200 μl細(xì)菌（XL1blue菌）懸液，37 ℃下孵育20 min。加入10 ml已融的頂層瓊脂，鋪于預(yù)熱至37 ℃的含四環(huán)素的LB瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)4～6 h。覆蓋經(jīng)10 mmol/L IPTG浸泡并已涼干的NC膜，繼續(xù)倒置培養(yǎng)3 h。取出NC膜，置于己經(jīng)預(yù)吸收的抗血清中，用PBST漂洗，DAB底物顯色，陽(yáng)性反應(yīng)斑為棕色圓形中空斑。初篩陽(yáng)性克隆經(jīng)適當(dāng)稀釋后再?gòu)?fù)篩3次，直至NC膜上全部斑點(diǎn)均為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.3陽(yáng)性克隆的初步鑒定。從3次復(fù)篩得到的陽(yáng)性克隆中挑取單個(gè)嗜菌斑，加入500 μl 1×λ稀釋緩沖液，混勻后4 ℃洗脫過(guò)夜。取5 μl洗脫液進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃下保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μl于1%瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min，凝膠成像儀拍照并存盤。

2結(jié)果與分析

2.1間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)抗體選用比率表示法判定ELISA試驗(yàn)結(jié)果，該方法是用測(cè)定樣品的酶標(biāo)孔（P）與陰性樣品的酶標(biāo)孔（N）平均吸收值的比值（P/N）表示。當(dāng)P/N≥2.1，為陽(yáng)性；若P/N<2.1，為陰性。堆型艾美耳球蟲抗血清經(jīng)ELISA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P/N為13.068，因此確定E.acervulina抗血清為陽(yáng)性（如表1所示）。

3討論

筆者采用E.acervulina可溶性抗原免疫兔子，獲得E.acervulina抗血清，該血清中可能含有大腸桿菌抗體，為減少或消除免疫學(xué)篩選過(guò)程中造成的假陽(yáng)性結(jié)果，必須對(duì)所用的血清先去除大腸桿菌抗體。通常去除大腸桿菌抗體的方法有假篩選法、大腸桿菌裂解液吸收法以及親和層析法。筆者對(duì)去除大腸桿菌抗體的方法進(jìn)行了一些改進(jìn)，即用硝酸纖維素膜裁剪后，浸泡于大腸桿菌裂解液中，烘干后用封閉液4 ℃封閉過(guò)夜，再置于經(jīng)適當(dāng)稀釋的抗血清中浸泡過(guò)夜。該方法盡量保持了抗血清中抗體的量和活性，一次性吸收較完全，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，無(wú)需其他特殊試劑，且節(jié)省了材料，增加了陽(yáng)性克隆的機(jī)率。

利用E.acervulina陽(yáng)性血清對(duì)cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，將初步篩選到的疑似陽(yáng)性斑重復(fù)篩選3次后，疑似陽(yáng)性斑仍呈陽(yáng)性，表明該重組陽(yáng)性克隆嗜菌體株可以較穩(wěn)定地表達(dá)堆型艾美耳球蟲特異性抗原蛋白成分。采用PCR技術(shù)鑒定3次篩選后的陽(yáng)性克隆是一種十分簡(jiǎn)便而有效的方法[8]。采用PCR方法初步鑒定了6個(gè)陽(yáng)性克隆，插人片段大小為1 000～1 500 bp。

Christensen[9-10]報(bào)道在同一宿主體內(nèi)寄生的不同種寄生蟲之間存在生物學(xué)上的拮抗或協(xié)同作用，而近緣種間的拮抗性可能是由于這些寄生蟲之間存在共同抗原。研究這些共同抗原的組分對(duì)于相關(guān)寄生蟲病的免疫診斷和免疫預(yù)防具有重要意義。免疫預(yù)防是控制和消滅雞球蟲病的有效途徑之一，目前很多疫苗分子是應(yīng)用免疫學(xué)方法從雞球蟲cDNA文庫(kù)中篩選出來(lái)的。Jenkins[11]等以E.acervulina子孢子和裂殖子為材料構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中獲得2個(gè)表達(dá)表面抗原的克隆，其編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)125I標(biāo)記、免疫印跡法、免疫熒光法和T細(xì)胞激活試驗(yàn)來(lái)識(shí)別。這2個(gè)克隆，1個(gè)命名為cSZ1，為分子量130 kD的β半乳糖苷酶（βgalactosidase）融合蛋白，應(yīng)用抗cSZ1血清對(duì)活的或1%多聚甲醛固定的堆型艾美耳球蟲子孢子進(jìn)行的免疫熒光試驗(yàn)已經(jīng)確認(rèn)這種蛋白在子孢子表面的位置，但這種蛋白不能被感染E.acervulina的雞血清所識(shí)別，也不能在體外激活T淋巴細(xì)胞；另1個(gè)克隆命名為cMZ8，為分子量250 kD的裂殖子抗原，應(yīng)用抗cMZ8血清對(duì)125I標(biāo)記的裂殖子蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，對(duì)活的及1%多聚甲醛固定的堆型艾美耳球蟲裂殖子進(jìn)行免疫熒光染色，可以證實(shí)純化的cMZ8蛋白能被感染E.acervulina的雞血清所識(shí)別，并且具有在體外誘導(dǎo)免疫T淋巴細(xì)胞的顯著活性。雞球蟲基因工程疫苗研究自20世紀(jì)80年代開展以來(lái)，到目前為止仍未找到理想的候選分子，因此繼續(xù)尋找候選分子仍然是雞球蟲基因工程疫苗研制中最為關(guān)鍵的一環(huán)。該試驗(yàn)篩選出的陽(yáng)性克隆，為繼續(xù)尋找雞球蟲疫苗提供了新選擇。

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