唐慶明等

摘要[目的]對(duì)采自內(nèi)蒙古根河地區(qū)的灰紫香蘑進(jìn)行組織分離與鑒定。[方法]分別選取菌蓋處、菌褶與菌柄交界處和菌柄處進(jìn)行組織分離，將分離物進(jìn)行ITS序列分析，計(jì)算遺傳距離，并采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]菌褶與菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲生長(zhǎng)速度快、潔白細(xì)密、污染率低；其次，子實(shí)體自然風(fēng)干3 d后再進(jìn)行分離可有效降低菌絲污染程度；最后分離物經(jīng)ITS序列測(cè)定，系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)其為灰紫香蘑。[結(jié)論]該方法獲得了灰紫香蘑的純培養(yǎng)菌株，為進(jìn)一步開發(fā)和利用灰紫香蘑提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞灰紫香蘑（Lepista glaucocana）；組織分離；ITS序列鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)S646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）14-04192-02

Isolation and Identification of Lepista glaucocana by ITS Gene Sequence

TANG Qingming et al （Hulun Buir Forestry Bureau，Hulun Buir，Inner Mongolia 021008）

Abstract [Objective] To isolate，cultivate and accurately identify Lepista glaucocana which was collected from Genhe district in Inner Mongolia. [Method] Different tissues from pileus，stipe，junction of pileus and stipe were isolated，then the isolate was identified by internal transcribed spacer （ITS），the genetic distance was calculated，and a NJ systematic tree was established by the neighborjoining method. [Result] The results showed that junction of pileus and stipe is the best isolation position，which mycelia with fast growth and low pollution； Secondly，it is lower pollution when airdry the fruiting body for 3 days； At last，the isolate was identified as L.glaucocana analyzed by phylogenetic relationship of ITS gene sequences. [Conclusion] The pure strain was obtained which can provide a scientific basis for development and use of L. glaucocana.

Key words Lepista glaucocana； Tissue isolation； ITS sequence； Phylogenetic relationship

灰紫香蘑（Lepista glaucocana）隸屬于真菌門（Enmycophyta）擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑屬（Lepista）[1]。子實(shí)體中等稍大、菌蓋淡紫色或丁香紫色，后褪至白色，是一種優(yōu)良的食用菌。其氣味濃香，色澤宜人，鮮食、干食風(fēng)味俱佳，是具有很高開發(fā)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)野生食用菌資源[2]。目前，灰紫香蘑的報(bào)道不多，人工馴化方面還未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，雖有對(duì)灰紫香蘑菌絲體分離的研究報(bào)道[2-3]，但關(guān)于其對(duì)得到的菌絲體進(jìn)行鑒定的研究鮮有報(bào)道。為了保護(hù)及開發(fā)利用該資源，筆者采用組織分離法對(duì)灰紫香蘑進(jìn)行了菌種分離純化及ITS序列鑒定，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用灰紫香蘑提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料以2013年9月采自內(nèi)蒙古根河地區(qū)的灰紫香蘑作為供試菌種，試驗(yàn)材料應(yīng)選擇朵型正常、無(wú)病蟲害、無(wú)破損和生長(zhǎng)健壯的灰紫香蘑子實(shí)體。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 ml，pH自然。

1.2.2不同組織部位對(duì)分離的影響。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行組織分離，將子實(shí)體用濃度75%的乙醇擦拭表面2～3遍；用滅過(guò)菌的解剖刀沿菌菇縱向劃開小口，用手輕輕掰開；用接種鉤在菌蓋處、菌褶和菌柄交界處及菌柄處鉤取一塊菌肉組織；將其迅速移入預(yù)先制備好的PDA平板培養(yǎng)基上，每皿接4塊菌肉組織，設(shè)置3組重復(fù)，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)，觀察各組織部位的長(zhǎng)勢(shì)情況。

1.2.3子實(shí)體風(fēng)干程度對(duì)分離的影響。分別分離新鮮的子實(shí)體和經(jīng)過(guò)自然風(fēng)干3 d的子實(shí)體，各接4塊菌肉組織于PDA平板培養(yǎng)基上，設(shè)置3組重復(fù)，置于25 ℃恒溫條件下避光培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲污染情況。

1.2.4基因組DNA的提取、擴(kuò)增及鑒定。采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根）分別對(duì)灰紫香蘑的子實(shí)體和分離培養(yǎng)得到的菌絲體進(jìn)行基因組DNA的提取。用消過(guò)毒的接種鉤鉤取子實(shí)體菌褶內(nèi)純凈的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨。刮取分離菌株培養(yǎng)基上的菌絲體，放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟參照說(shuō)明書。

圖3子實(shí)體及其分離菌株的rDNA ITS擴(kuò)增圖譜圖4NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹2.4系統(tǒng)發(fā)育分析在NCBI中，進(jìn)行BLASTN搜索，得到的同源序列主要是同屬和近緣屬的不同種，其中與Lepista nuda的相似度最高為99%，但在比對(duì)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)灰紫香蘑的ITS序列。下載上述相似物種中有代表性的ITS序列，用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并輔以人工修正。基于來(lái)自NCBI中的7個(gè)種的ITS序列，以子囊菌亞門的冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）作為外參，連同試驗(yàn)中的ITS序列共9個(gè)序列一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用MEGA 4.0中的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)樹。圖4表明，M2與香蘑屬的Lepista nuda具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其次是Tricholoma mongolicum和Lepista sordida；與近緣屬的Clitocybe subditopoda、Collybia tuberosa序列差異較大，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。

3結(jié)論與討論

對(duì)于食用菌的人工馴化，首先需要解決食用菌的菌種分離問(wèn)題。常見(jiàn)的菌種分離方法主要有組織分離法、孢子分離法和基內(nèi)菌絲分離法3種。其中組織分離法因操作簡(jiǎn)單，純化率高在實(shí)踐中被廣泛地應(yīng)用[6]。試驗(yàn)采用組織分離法對(duì)灰紫香蘑子實(shí)體不同部位進(jìn)行的分離試驗(yàn)結(jié)果表明，野生灰紫香蘑可在實(shí)驗(yàn)室條件下成功分離且菌褶和菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲不但生長(zhǎng)致密潔白、生長(zhǎng)速度快，并且子實(shí)體自然風(fēng)干3 d后再進(jìn)行組織分離，菌絲培養(yǎng)較不易受雜菌污染。

目前菌種鑒定，遺傳多樣性研究主要基于形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞水平、生化水平及分子水平得以開展[7]，其中ITS序列分析法因準(zhǔn)確性高，簡(jiǎn)便易行而具有很大的實(shí)用價(jià)值。由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進(jìn)化過(guò)程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異[8]。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進(jìn)化特征[9]。通過(guò)對(duì)供試子實(shí)體與菌絲體ITS區(qū)段長(zhǎng)度比對(duì)，驗(yàn)證了供試菌絲體就是灰紫香蘑的分離物。把待測(cè)真菌ITS區(qū)段的DNA擴(kuò)增出來(lái)，并測(cè)出其序列，然后與數(shù)據(jù)庫(kù)中的資料進(jìn)行比對(duì)，即可確定供試真菌的分類地位。這種鑒定方法允許少量的序列分析誤差或少量錯(cuò)配，不僅用于分類鑒定，還可對(duì)真菌類群作系統(tǒng)發(fā)育分析。借助于ITS序列分析法，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，擬從分子水平上揭示野生菌株的遺傳背景，反映種間的遺傳親緣關(guān)系，為進(jìn)一步資源保護(hù)、馴化和開發(fā)利用等工作奠定基礎(chǔ)。

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