劉曉 許琳婧 孫麗萍

【摘 要】目的：探討不同樣本處理方法對乳汁樣本中HBV DNA定量結(jié)果的影響，篩選出適合臨床實(shí)驗(yàn)室檢測病毒DNA的樣本前處理方法。方法：4℃冰箱過夜后取中間層乳汁進(jìn)行檢測，以離心后的上清液、上清液濃縮、沉淀3種方法平行檢測52份大三陽產(chǎn)婦的乳汁HBV DNA含量。結(jié)果：沉淀方法檢測陽性率明顯高于其他2種方法（均P<0.05）。與其他2種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)論：4℃冰箱過夜后取中間層乳汁離心沉淀檢測HBVDNA是比較準(zhǔn)確可靠的，方法簡單易行，值得臨床推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】FQ-PCR；HBV DNA；乳汁

【中圖分類號】R446.62 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0760-01

我國是乙型肝炎的高流行區(qū)，人群乙型肝炎病毒（HBV）攜帶率高達(dá)10%～20%，超過1.2億，其中40%～50%通過母嬰傳播[1-2]，母乳含有豐富的營養(yǎng)成分和免疫物質(zhì).是嬰兒成長最理想的營養(yǎng)品。若母乳HBV-DNA陽性.采取退乳及人工喂養(yǎng)已成為共識[3]。然而，乳汁組成復(fù)雜，富含脂肪、蛋白質(zhì)及乳糖[4]，且乳汁為渾濁非勻相液體，與血清不同，因而適用于血清標(biāo)本中HBV-DNA檢測的方法是否適用于乳汁標(biāo)本有待探討。目前國內(nèi)尚無標(biāo)準(zhǔn)化的乳汁中HBV-DNA檢測程序，各學(xué)者采用的研究方法和結(jié)果不盡相同。建立標(biāo)準(zhǔn)化的乳汁中HBV-DNA檢測方法勢在必行。本研究僅從乳汁成分對實(shí)時熒光定量檢測HBV-DNA的影響及HBV-DNA在乳汁中分布情況著手，以期為乳汁中HBV-DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)方法的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 材料收集 分娩24h內(nèi)的初乳采自2013年1月1日至12月31日在本院產(chǎn)科病房分娩的產(chǎn)婦，其血清HBsAg陽性，血清中HBV DNA拷貝數(shù)大于1.0×103IU/mL，谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶均小于40U/L，共52例，平均年齡25.6歲，平均孕齡38周。用溫水清洗乳頭，然后輕輕擠出初乳約1.5～2.5mL，置于無菌塑料管中，-20℃保存。標(biāo)本的采集與保存按照本實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）進(jìn)行。患者沒有失代償?shù)母尾』蚋伟?，未檢測到HAV、HCV、HDV、HEV和HIV，并已排除酒精性、藥物性、中毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病、代謝性肝病。每份標(biāo)本同時用兩種提取法提取HBV DNA模板后，進(jìn)行HBV DNA實(shí)時熒光定量PCR （ FQ - PCR）檢測。

1.1.2 儀器及試劑 儀器為美國ABI公司7500 Real Time PCR System檢測儀。運(yùn)行計(jì)算機(jī)軟件為Roche Molecular Biochemicals Light-Cycler Software（Version 3.5.3）。血清HBV DNA檢測試劑盒來自上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司[國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2009第3400437號]，生產(chǎn)批號20130501，試劑盒的檢出限為5×102IU/ml。DNA標(biāo)準(zhǔn)品為試劑盒中所帶的定量標(biāo)準(zhǔn)品，室內(nèi)質(zhì)控血清由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)室為衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心技術(shù)認(rèn)可的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

方法I（上清液） 先取冰箱過夜后的乳汁800μL于一個無菌Eppendorf離心管（Ep管）中；然后4℃，15 000 r/min離心10 min，去除脂肪層，取中問層上清液100μL，加入100μL DNA提取液。

方法II（上清液濃縮） 取經(jīng)過方法I處理的中間層上清液100μL，接著加等量試劑盒自帶濃縮液，充分混合，然后4℃。15 000 r/min離心10 min，棄上清液，最后加入100μLDNA提取液。

方法Ⅲ（沉淀） 去除冰箱過夜后的乳汁上層的乳酪，取中層乳汁100μL于一個無菌Ep管中，4℃，15 000 r/min離心10 min。棄上清液，加入100μL DNA提取液。

1.2.2 擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)條件為50℃反應(yīng)2分鐘，然后94℃保溫5分鐘，再按93℃30秒→60℃90秒（循環(huán)40次）。60℃采集FAM熒光通道的信號。

1.2.3 檢測結(jié)果的解釋 擴(kuò)增運(yùn)行程序完成后，按儀器及軟件要求進(jìn)行結(jié)果保存和數(shù)據(jù)分析。除檢測標(biāo)本外，本實(shí)驗(yàn)設(shè)有陽性血清對照、弱陽性血清對照、陰性對照、室內(nèi)質(zhì)控品以及4 個定量校準(zhǔn)品。定量檢測線性范圍為103～107IU/ ml，如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值=40，則判定樣品的HBV DNA含量小于檢測極限。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用χ2檢驗(yàn)，經(jīng)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2 結(jié)果

3種前處理方法對52份乳汁標(biāo)本檢測結(jié)果比較見表1。統(tǒng)計(jì)分析表明，方法Ⅲ與其他2種方法比較，其檢測陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

3 討論

母乳中適于嬰兒生長發(fā)育的各種營養(yǎng)物質(zhì)及多種抗病物質(zhì)是其他人工配方食品不可比擬的，應(yīng)該大力倡導(dǎo)母乳喂養(yǎng)。然而由于許多傳染病可通過哺乳傳播，有報(bào)道30% ～50%慢性乙肝攜帶者是由母嬰傳播的，其原因也包含了哺乳途徑，通常新生兒在接種乙肝疫苗6個月后體內(nèi)的抗體才能達(dá)到有效濃度，12個月后乙肝表面抗體的陽轉(zhuǎn)率才達(dá)到85%以上，仍有9% ～10%的嬰幼兒對疫苗不產(chǎn)生抗體，對乙肝病毒無免疫力，消化道若有黏膜損傷，在母乳喂養(yǎng)期間極易導(dǎo)致感染，因而母乳的安全性是一個不容忽視的問題[5] 。目前，國內(nèi)外大多臨床實(shí)驗(yàn)室均采用實(shí)時熒光定量PCR檢測HBV DNA，所用試劑對血清樣本檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，但對乳汁樣本檢測重復(fù)性較差。主要是乳汁樣本含大量脂肪顆粒，乳液均一性差，使得HBV DNA分布不均勻，由于產(chǎn)婦每天飲食的差異，故每次檢測所取樣本脂肪顆粒含量不可能完全一致，導(dǎo)致乳汁樣本的病毒DNA檢測結(jié)果不穩(wěn)定。為提高乳汁樣本病毒DNA檢測穩(wěn)定性和重復(fù)性，必須對乳汁樣本進(jìn)行合理的前處理，使得經(jīng)處理的樣本檢測結(jié)果重復(fù)性、精密度都能提高到滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控需要，同時檢測結(jié)果盡可能地接近真實(shí)值。乳汁樣本不同的前處理方法，其可靠性、可操作性、經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性差別較大，因此有必要進(jìn)行優(yōu)化篩選[6，7]。

本研究對比了乳清和沉淀的DNA檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)沉淀的陽性率及DNA濃度均明顯高于乳清，而乳清和濃縮乳清的結(jié)果沒有顯著差異。因此，對于乳汁的HBV DNA檢測還是應(yīng)該取沉淀進(jìn)行檢測，因?yàn)槿橹胁《镜拇嬖谛问娇赡懿煌谘?，病毒可能會存在于淋巴?xì)胞內(nèi)，或附著在細(xì)胞、大分子上，檢測上清液可能會降低敏感性。通過以上實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)，對乳汁樣本病毒DNA檢測，樣本處理很關(guān)鍵，樣本前處理方法不同，檢測結(jié)果相差很大，甚至有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，在進(jìn)行乳汁樣本檢測病毒DNA時，一定要選擇合適的前處理方法。

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