李嘉鋅等

【摘 要】目的：研究藍(lán)萼甲素對人宮頸癌Hela細(xì)胞生長的抑制作用及對細(xì)胞周期的影響。方法：四氮唑噻唑藍(lán)（ MTT ）法檢測不同濃度藍(lán)萼甲素分別在48， 72 h對Hela細(xì)胞的抑制作用； 流式細(xì)胞儀（ FCM ） 檢測藍(lán)萼甲素對Hela細(xì)胞周期的影響； Western blot法檢測p53蛋白的表達(dá)。結(jié)果：不同質(zhì)量濃度（ 2-20μmol/l） 藍(lán)萼甲素對Hela細(xì)胞的毒性均有明顯劑量和時間依賴性， 其48， 72 h的IC50值分別為：3μmol/l，1.5μmol/l； 藍(lán)萼甲素可使Hela細(xì)胞細(xì)胞周期的構(gòu)成發(fā)生明顯的變化。Western blot表明， 藍(lán)萼甲素作用Hela細(xì)胞后p53的蛋白水平表達(dá)逐漸升高。結(jié)論：藍(lán)萼甲素對宮頸癌H e la細(xì)胞有細(xì)胞毒性，其作用機制可能是使Hela細(xì)胞生長停滯在G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使S期細(xì)胞比例降低； 使p53功能恢復(fù)， 從而起到殺傷腫瘤的作用。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌； Hela細(xì)胞；藍(lán)萼甲素；蛋白p53

【中圖分類號】R737.33；R73.36 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0576-02

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均居于女性惡性腫瘤前列。目前的研究顯示宮頸癌的發(fā)生與高危型HPV感染密切相關(guān)，但并不是所有感染了HPV的患者都最終進(jìn)展為宮頸癌，提示宮頸癌的發(fā)生發(fā)展還有多種因子參與。隨中藥提取工藝的提高，中藥在宮頸癌治療機制方面的研究更加細(xì)化。世界各個國家的醫(yī)學(xué)研究均發(fā)現(xiàn)香茶菜屬植物具有廣泛的藥理學(xué)作用，香茶菜屬植物種類繁多，中醫(yī)記載具有清熱解毒、活血化瘀、抗菌消炎、抗腫瘤、治療各種肝炎等功效。近年來對其中的二萜類化合物的研究較多。藍(lán)萼甲素（Glaucocalyxin A，GLA）正是由唇形科香茶菜中分離提取出的二萜化合物，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼甲素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如肝癌HepG2細(xì)胞株、卵巢癌HO8910細(xì)胞株、口腔鱗狀細(xì)胞癌Tb細(xì)胞株、白血病HL-60細(xì)胞株等[1]。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，有研究顯示藍(lán)萼甲素通過抑制DNA， RNA和蛋白質(zhì)合成而干擾細(xì)胞周期中的運行，延緩細(xì)胞周期，起到抗癌作用。本實驗主要研究藍(lán)萼甲素對宮頸癌細(xì)胞系Hela的細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期的影響， 初步探討其抗腫瘤作用的機制。

1 材料

1.1 試劑與藥品 1640（購自Gibco公司）； MTT（四氮唑噻唑藍(lán)， 四甲基偶氮唑鹽） 購自Sigma-aldrich；胎牛血清購自碧云天生物技術(shù)研究所； 鼠抗人p53單抗購自碧云天生物技術(shù)研究所； 藍(lán)萼甲素純度> 98%，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥化實驗室白素平教授及其課題組從藍(lán)萼香茶菜中提取所得，純度達(dá)98%以上， 使其溶解于適量的二甲基亞砜（ DMSO ） ， 終質(zhì)量濃度為011% ， 過濾除菌， 4℃冰箱密封避光保存。112 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo E lectron Corporation），流式細(xì)胞儀（美國Beckm an A ltra ? ） ， 超凈工作臺（蘇州精華設(shè)備公司） ， 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices）， AE2405 電子分析天平（上海美特勒-托利多儀器有限公司） ， 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)板。

2 方法

2.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞株Hela由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理實驗室千新來教授贈與。Hela細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，用1640 培養(yǎng)液（含10% 新生胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U # mL-1） ， 置于37℃， 5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)， H ela細(xì)胞為梭形， 呈貼壁生長， 孵育2～ 3 d后用0.125% 胰蛋白酶消化傳代， 選對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

2.2 MTT 法檢測藍(lán)萼甲素對He la細(xì)胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后細(xì)胞計數(shù)， 將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/ml，空白對照組給予等體積的PBS；給藥組分別加入不同濃度的藍(lán)萼甲素，其質(zhì)量濃度依次為48小時1，1.5，3，4.5，6，7.5，9，10.5，12，13.5。72小時濃度為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)48，72 h后，加入10μl的MTT液（ 20 μL /孔）4h后，吸去上清加每孔加入150ul二甲基亞砜微型震蕩器震蕩10min，使完全混勻溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上于578nm 處測其吸光度，每個劑量設(shè)平行重復(fù)6孔，實驗重復(fù)3次。按以下公式計算抑制率， 擬合后求IC50值。細(xì)胞增殖抑制率= （ 1-A試驗組/A對照組）×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測藍(lán)萼甲素對Hela細(xì)胞周期的影響 取對數(shù)生長的Hela細(xì)胞， 以1×105個/mL的密度接種于6孔板， 分別設(shè)有空白組、給藥組（ 48，72h ）。藍(lán)萼甲素給藥質(zhì)量濃度為（ 1.5μmol，IC50值） ， 空白組給予不加藥物的細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，胰酶消化，離心（ 1000 r# min-1，5min）， PBS洗2次，用70%的冷乙醇使細(xì)胞懸浮固，定輕輕吹打混勻，置4℃存12至24小時。碘化丙啶染色液染色后緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30分鐘。隨后4℃或冰浴避光存放，后流式細(xì)胞儀監(jiān)測分析，每組實驗重復(fù)3次。

2.4 蛋白免疫印跡試驗（Western blot） 給藥后， 收集對數(shù)生長的Hela細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置15min， 12000 r# min- 1離心15m in，取上清，以Bradford法作蛋白定量后置-80℃貯存?zhèn)溆?。灌?0% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗（ 1B500），4℃孵育過夜，二抗（ 1B5000），室溫孵育2h，ECL顯色。B-actin檢測作為內(nèi)對照， 進(jìn)行細(xì)胞間蛋白表達(dá)的比較。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS1310軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s 表示， 組間比較采用One-wayANOVA檢驗。

3 結(jié)果

3.1 藍(lán)萼甲素對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT法檢測， 不同濃度的藍(lán)萼甲素分別給藥 48， 72 h后， 對Hela細(xì)胞的生長呈明顯抑制作用。藥物作用48， 72 h的IC50值分別為3，1.5μmol。結(jié)果表明細(xì)胞增殖的抑制率與藥物濃度及作用時間密切相關(guān)， 單因素方差分析結(jié)果表明不同藥物濃度與空白組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異（P <0.05或P < 0.01， 表1和表2）。

在時間相同濃度不同情況下，細(xì)胞的抑制率隨濃度的增大而增大，在時間不同濃度相同的情況下，細(xì)胞的抑制率隨時間的延長而增大。

3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

Hela細(xì)胞經(jīng)給藥組處理， PI染色后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行監(jiān)測分析。結(jié)果表明與空白對照組相比較，給藥組效果更加顯著， 使Hela細(xì)胞生長產(chǎn)生G1期阻滯， S期所占比例隨給藥時間的延長不斷減少，Sub-G1減少。

本圖72小時濃度為6，7.5 和空白對照組。

3.3 Western blot法對相關(guān)蛋白的檢測

宮頸癌Hela細(xì)胞藍(lán)萼甲素1.5μmol處理72小時后，Western blot法檢測， 隨著藥物作用時間的延長， p53的表達(dá)逐漸增加（圖）。

4 討論

宮頸癌患者放療后局部控制率低和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高， 嚴(yán)重影響其臨床療效， 因而高效低毒的放射增敏藥物能廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究[2]。高立文等發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼甲素主要是通過作用于HL-60細(xì)胞后，導(dǎo)致氧自由基的爆發(fā)以及線粒體膜電位的下降，并導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C的釋放，調(diào)節(jié)有關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的[3]。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，有研究顯示藍(lán)萼甲素通過抑制DNA， RNA和蛋白質(zhì)合成而干擾細(xì)胞周期中的運行，延緩細(xì)胞周期，起到抗癌作用。另有研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼甲素也可能通過調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)而抑制腫瘤的形成[4]。在宮頸癌方面，夏維和黃敬敬等分別在人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞和腺癌HeLa細(xì)胞中研究證實藍(lán)萼甲素可明顯抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖，可能通過下調(diào)bcl-2的表達(dá)和上調(diào)bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinylaspartate-specific protease-3，caspase-3）、caspase-9的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯[5-6]。細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展與消退有密切關(guān)系，某些抗腫瘤藥物作用的強弱就與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性成正比。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為研究抗腫瘤藥物的新靶點， 以及評價療效的一項新指標(biāo)[ 7]細(xì)胞周期的阻滯與分化、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。如果S期占細(xì)胞周期的比例高， 則提示DNA的合成活躍。一般腫瘤細(xì)胞的S期比例較正常細(xì)胞要高， 其增殖活性也較正常細(xì)胞高， S期細(xì)胞明顯減少， 說明其增殖活性已有所減弱[8].目前， 隨著研究越來越廣泛， 許多分化誘導(dǎo)劑能抑制腫瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)其分化， 主要是由某些癌基因及抑癌基因的表達(dá)抑制、失活和活化所致， 其作用機制可能是通過抑制細(xì)胞原癌基因、誘導(dǎo)抑癌基因的表達(dá)， 抑制細(xì)胞進(jìn)入S期及DNA合成， 從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化[9]。本實驗通過MTT法檢測顯示，不同濃度的藍(lán)萼甲素對Hela細(xì)胞毒性有明顯劑量和時間依賴性； 流式細(xì)胞儀檢測表明： 藍(lán)萼甲素Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期有明顯的影響，在抑制He la細(xì)胞增殖的同時，可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期， 使S期細(xì)胞比例降低， 使腫瘤細(xì)胞的增殖速度減慢， 抑制DNA的合成并加速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，與人類的腫瘤有關(guān)，并發(fā)揮著重要的抑癌作用[10]。野生型p53能夠發(fā)揮維持基因組穩(wěn)定、抑制或阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，從而能夠抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。[10]。 p53與細(xì)胞DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，是腫瘤抑癌基因之一[11]。在細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時，P53蛋白能使細(xì)胞分裂中止在G1/S 期，以便細(xì)胞有足夠的時間修復(fù)損傷，恢復(fù)正常狀態(tài)[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)， 藍(lán)萼甲素（1.5μmol/l）能夠通過Western blot觀察到p53蛋白表達(dá)增加。

綜上所述， 藍(lán)萼甲素能明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖， 其作用機理使p53的蛋白水平表達(dá)逐漸升高，p53啟動，從而誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。但其確切的作用機制還需進(jìn)一步的研究證實。

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