葉宇飛等

摘 要：建立了雞肉樣品中氧氟沙星對(duì)映體液相色譜熒光檢測(cè)（liquid chromatography fluorescence detector，

LC-FLD）殘留量快速分析方法。雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，用C18固相萃取小柱凈化，洗脫液吹干后用流動(dòng)相復(fù)溶即可進(jìn)行液相色譜分析。分析時(shí)采用LeapsilTM C18色譜柱，以水相（含2 mmol/L硫酸銅和2.5 mmol/L異亮氨酸，pH3.5）和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度分析，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，其中激發(fā)波長(zhǎng)為297 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為487 nm，外標(biāo)法定量。本方法在5.0、50、100 μg/kg和150 μg/kg 4 個(gè)添加水平下，左氧氟沙星對(duì)映體平均添加回收率在75.5%～86.1%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在1.97%～4.42%之間，批間變異系數(shù)在3.02%～6.02%之間；右氧氟沙星對(duì)映體平均添加回收率在77.3%～84.9%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在2.15%～4.21%之間，批間變異系數(shù)在3.87%～5.84%之間。方法對(duì)兩種對(duì)映體的檢測(cè)限均為1.5 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg。

關(guān)鍵詞：氧氟沙星；手性對(duì)映體；液相色譜法；固相萃取

Determination of Residual Ofloxacin Enantiomers in Chicken Muscle by Liquid Chromatography

YE Yu-fei1， Liu Yong-jun2， ZHAO Jian1， Lü Yan1， WU Yin-liang1，*

（1. The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；

2. The Center for Animal Disease Control and Prevention， P.R. China， Beijing 100125， China）

Abstract： A method was developed for determining residual ofloxacin enantiomers in chicken muscle by liquid chromatography with fluorescence detection. Samples were extracted with phosphate buffer solution. The extract was purified by solid phase extraction （SPE） using a C18 cartridge and the eluent was then dried by nitrogen blowing and dissolved in mobile phase. The analytes were separated on a LeapsilTM C18 column using a mobile phase composed of a mixture of methanol and aqueous solution of （pH 3.5） 2 mmol/L copper sulfate and 2.5 mmol/L isoleucine. Excitation wavelength was 297 nm and emission wavelength was 487 nm. Quantitation was performed by using the external standard calibration method. The average recoveries for the two enantiomers in spiked chicken muscle were 75.5%–86.1% at four fortified levels ranging from 5 to 150 μg/kg， and the intra- and inter-batch coefficients of variation （CVs） were 2.15%–4.21% and 3.87%–5.84%， respectively. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ） were 1.5 and 5.0 μg/kg for the two enantiomers of ofloxacin， respectively.

Key words： ofloxacin； enantiomers； liquid chromatography； solid phase extraction

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2014）05-0025-04

氧氟沙星（ofloxacin），又名氟嗪酸，屬于氟喹諾酮類(lèi)（fluoroquinolones）抗菌藥，具有抗菌譜廣，組織穿透性好，低濃度即呈現(xiàn)較強(qiáng)的殺菌作用及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床以及畜牧業(yè)生產(chǎn)中。然而，它在動(dòng)物源性食品中的殘留以及引起病原菌的耐藥性問(wèn)題已受到普遍的關(guān)注和重視?？涩F(xiàn)對(duì)于評(píng)估該藥物對(duì)健康造成的危害時(shí)，僅對(duì)該藥物作為純的單一化合物來(lái)看等，未考慮該藥物是手性藥物這一特征。而手性藥物不同異構(gòu)體之間在毒性、致畸、致癌、致突變上往往存在差異，必然導(dǎo)致對(duì)其危害估計(jì)不是過(guò)高就是過(guò)低?，F(xiàn)生產(chǎn)中仍然大量使用氧氟沙星外消旋體，而大量實(shí)驗(yàn)表明氧氟沙星在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的代謝具有立體選擇性[1]，導(dǎo)致氧氟沙星兩對(duì)映體含量不一致。因此為安全評(píng)估該藥物對(duì)人體健康造成的危害，首先應(yīng)建立該藥物在動(dòng)物組織中的對(duì)映體殘留分析方法。

由于氟喹諾酮類(lèi)抗生素對(duì)動(dòng)物性食品安全的影響較大，目前無(wú)論國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物性食品中的氟喹諾酮類(lèi)抗生素殘留的分析方法較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法[2-3]、液相色譜法[4-7]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]等；但對(duì)生物樣品中氧氟沙星對(duì)映體水平上的分析方法研究多集中在生物體液，而對(duì)動(dòng)物組織中的對(duì)映體分析報(bào)道國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。氧氟沙星的手性分離方法主要包括采用手性流動(dòng)相或衍生的方法以及采用手性色譜柱進(jìn)行分離[10-20]。本實(shí)驗(yàn)采用手性流動(dòng)相添加劑法實(shí)現(xiàn)了氧氟沙星映體的拆分，并在參考前人對(duì)動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留分析的基礎(chǔ)上，建立了提取、凈化效果較好，分離較快的雞肉中氧氟沙星對(duì)映體殘留量分析方法，該方法的建立為進(jìn)一步研究氧氟沙星在對(duì)映體水平上的毒性毒理、代謝等奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空白雞肉樣品 市購(gòu)，實(shí)驗(yàn)用肉雞為健康肉雞，體質(zhì)量0.5 kg左右，用藥前測(cè)定是否含氧氟沙星。

氧氟沙星（99%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；左旋氧氟沙星（99%） 河南赫福萊生物制藥有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)默克公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)天地有限公司；Bond Elut C18（200mg3/mL） Varian公司；pH7.0磷酸鹽緩沖液 實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；SIGMA3K15離心機(jī) 北京博勵(lì)行有限公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱(chēng)取氧氟沙星和左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品或原藥各100.0 mg于10 mL容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，即成質(zhì)量濃度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，―18 ℃條件下保存，保質(zhì)期為6 個(gè)月。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用流動(dòng)相稀釋氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制質(zhì)量濃度分別為2.0、10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取2.0 g雞肉樣品于帶蓋的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液，然后以10 000 r/min以上的速度均質(zhì)60 s，蓋上蓋子以8 000 r/min的速度離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，同樣步驟重復(fù)提取一次，合并上清液，混勻后取10 mL提取液過(guò)已經(jīng)2 mL甲醇、2 mL磷酸鹽緩沖溶液依次活化的C18小柱，待樣品溶液流過(guò)固相萃取小柱后，依次用2 mL超純水和2 mL磷酸鹽緩沖溶液淋洗柱子，待全部溶液過(guò)柱后，抽干C18小柱，然后用2 mL甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)50℃水浴氮?dú)獯蹈珊笥?.00 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行液相色譜分析。

1.3.3 儀器條件

色譜柱LeapsilTM C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：pH3.5的2 mmol/L硫酸銅溶液（含2.5 mmol/L

異亮氨酸）∶甲醇=9∶1（V/V）；流速0.5 mL/min，

柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。激發(fā)波長(zhǎng)297 nm，發(fā)射波長(zhǎng)487 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件的選擇和優(yōu)化

對(duì)于氧氟沙星對(duì)映體的分離，研究較多，按儀器分主要為毛細(xì)管電泳手性拆分和高效液相色譜手性拆分，而應(yīng)用最廣泛最成熟的當(dāng)屬采用手性流動(dòng)相添加劑法分析氧氟沙星對(duì)映體。而當(dāng)采用手性流動(dòng)相添加劑法時(shí)，Cu2+經(jīng)常為配合離子，手性氨基酸為配合劑，手性氨基酸則通常為苯丙氨酸和異亮氨酸。Shao Bing等[18]曾詳細(xì)研究了異亮氨酸和硫酸銅溶液的濃度及兩者比例對(duì)氧氟沙星對(duì)映體的分離影響，確定硫酸銅溶液最佳濃度為4.0 mmol/L，異亮氨酸最佳濃度為5.0 mmol/L，

然而完全按照Shao Bing等[18]建立的方法進(jìn)行分析時(shí)每個(gè)樣品分析時(shí)間較長(zhǎng)，需要25 min， 同時(shí)熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）流通池也易堵塞， 為縮短分析時(shí)間和解決流通池易堵塞情況，本研究對(duì)色譜柱、硫酸銅和異亮氨酸濃度的濃度進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。

為縮短樣品分析時(shí)間，本研究首次嘗試采用UPLC對(duì)氧氟沙星對(duì)映體進(jìn)行分析。由圖1可知，實(shí)驗(yàn)中當(dāng)色譜柱采用內(nèi)徑較小的Acquity BHE C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中出現(xiàn)了4個(gè)色譜峰，而采用內(nèi)徑較大的色譜柱LeapsilTM C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）時(shí)只有2個(gè)色譜峰。這一現(xiàn)象目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，而根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)分析，氧氟沙星僅有2個(gè)對(duì)映體，因此本實(shí)驗(yàn)采用LeapsilTM C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）進(jìn)行后續(xù)的流動(dòng)相優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)降低硫酸銅和異亮氨酸濃度有利于解決熒光檢測(cè)器流通池易堵塞問(wèn)題，因此優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)硫酸銅和異亮氨酸的濃度為Shao等[18]優(yōu)化濃度的一半，分別為2 mmol/L和2.5 mmol/L。當(dāng)固定流動(dòng)相比例（90∶10）和柱溫（40 ℃）時(shí)，分離度隨流速升高（0.3～0.7 mL/min）而降低（1.55～1.18），但分析時(shí)間逐步縮短；而柱溫對(duì)分離度的影響較小，當(dāng)固定流動(dòng)相比例（90∶10）和流速（0.3 mL/min）時(shí)，分離度隨溫度升高（25～45℃）略有改善（1.35～1.45）。而改變流動(dòng)相比例對(duì)分離度影響較大，當(dāng)固定流速0.3 mL/min和柱溫30 ℃時(shí)，流動(dòng)相中有機(jī)相從10%變化到12%時(shí)，分離度從1.4降為0.94。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究中硫酸銅和異亮氨酸最終濃度分別為2 mmol/L和2.5 mmol/L，柱溫30 ℃，流動(dòng)相中水相有機(jī)相比例為90∶10，在此條件下先出峰的為左氧氟沙星，后出峰的為右氧氟沙星。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

仲鋒曾利用C18固相萃取小柱建立了雞肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的凈化方法[21]。本研究考慮到該凈化方法較簡(jiǎn)單方便，因此參考該方法對(duì)雞肉中的氧氟沙星進(jìn)行了凈化效果實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧氟沙星利用該凈化方法凈化效果較好，當(dāng)采用液相色譜熒光檢測(cè)分析時(shí)雞肉樣品中不存在明顯的雜質(zhì)峰干擾。

2.3 線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)氧氟沙星2 種對(duì)映異構(gòu)體在2.0～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以待測(cè)物峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為y=40 778x+9 772（左氧氟沙星）和y=39 517x+19 587（右氧氟沙星），相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 1和0.999 3，說(shuō)明本方法適用于2 種氧氟沙星對(duì)映體殘留量的定量分析。

2.4 回收率、精密度和檢出限

從表1可見(jiàn)，各濃度點(diǎn)平均添加回收率在75.5%～86.1%之間。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.97%～4.42 %，批間RSD為3.02%～6.02%，可見(jiàn)該方法能滿(mǎn)足現(xiàn)行藥物殘留分析的要求。本方法選擇5.0 μg/kg添加實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)最低樣品的信噪比，并按RSN為3計(jì)算2種氧氟沙星對(duì)映體的檢出限均為1.0 μg/kg，按RSN為10計(jì)算定量限均為5.0 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和添加樣品的色譜圖詳見(jiàn)圖1。

2.5 方法應(yīng)用

利用該方法進(jìn)行了氧氟沙星外消旋體在雞體內(nèi)氧氟沙星立體選擇性降解行為試驗(yàn)，停藥后1 d測(cè)定雞肉中氧氟沙星2 個(gè)對(duì)映體含量，發(fā)現(xiàn)左旋體含量為0.021 μg/g（n=3），右旋體含量為0.012 μg/g（n=3），可見(jiàn)氧氟沙星外消旋體在雞體內(nèi)降解存在立體選擇性。

3 結(jié) 論

本研究建立了雞肉中氧氟沙星對(duì)映體的快速測(cè)定LC-FLD

方法。雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，通過(guò)C18固相萃取小柱凈化，凈化后的樣品利用手性流動(dòng)相添加劑法在色譜柱上分離對(duì)映體，進(jìn)行LC-FLD法測(cè)定。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，利用該方法可為進(jìn)一步開(kāi)展氧氟沙星在對(duì)映體水平上的毒性毒理、代謝等研究奠定基礎(chǔ)。

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