雷旭光 張永玉 董巖 楊憲魯

[摘要]目的：進一步探討真皮多能干細胞 (dermal multipotential stem cells,DMSCs) 移植對大鼠皮膚光老化（skin photoage）后組織修復(fù)作用的影響。方法：SD大鼠58只隨機分為正常對照組（8只）、細胞移植組（25只）和PBS對照組（25只），細胞移植組和模型對照組采用UVA和UVB紫外燈同時進行照射制備皮膚光老化模型。體外分離培養(yǎng)DMSCs，吸取1ml細胞懸液（約1×106個）或等量PBS液分別于皮膚光老化區(qū)真皮層內(nèi)多點注射移植，正常對照組不做任何處理。移植后4周、8周分別采用VG染色和Weigert染色觀察皮膚全層膠原纖維、彈力纖維的表達變化；同時應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠皮膚真皮層vimentin的表達變化。結(jié)果：皮膚光老化損傷后，與對照組相比, DSMCs治療組大鼠受損皮膚組織出現(xiàn)較多的新生膠原纖維和彈力纖維； DMSCs移植治療組大鼠在真皮層內(nèi)vimentin染色陽性的成纖維細胞的數(shù)量明顯多于PBS對照組，移植后4周主要分布于真皮淺層，8周后廣泛均勻彌散在皮膚各層。結(jié)論：DMSCs 移植對大鼠光老化皮膚具有明顯的促進組織修復(fù)的作用。

[關(guān)鍵詞]真皮多能干細胞；皮膚光老化；移植; 大鼠

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2014）09-0726-04

Treatment skin photoaging of rat by dermal multipotential stem cells

LEI Xu-Guang,ZHANG Yong-yu,DONG Yan,YANG Xian-lu

(Department of Medical Cosmetic Surgery,Weihai Hospital,Weihai 264200,Shandong,China)

Abstract:ObjectiveTo explore further effect of histological repair for skin photoaging in rats by dermal multipotential stem cells (DMSCs) transplantation.Methods 58 SD rats were randomly divided into normal group (8 rats) ,cell transplantation group(25 rats) and PBS control group(25 rats).The rats of cell transplantation group and PBS control group were made into skin photoaging model by using the UVA and UVB ultraviolet light irradiated at the same time. DMSCs were isolated in vitro, then 1 ml cell suspension of DMSCs (about 1×106) or equivalent PBS were multi-point injected into photoaging skin of rats, rats of normal group did not make any processing. After 4 weeks and 8 weeks of cell transplanted, the collagen fibers and elastic fibers changes in full layer of photoaging skin were observed by using VG and Weigert staining respectively. Meanwhile,the expression change of vimentin in dermis layer were detected by using immunohistochemistry staining.Results After photoaging damaged, there are more new collagen fibers and elastic fibers in damaged skin tissue were observed in the DMSCs transplantation group, and the number of fibroblast which are vimentin positively staining in dermis layer of rats in DMSCs transplantation group were obviously more than PBS control group, which were mainly distributed in the dermis superficial layer at 4 weeks after cell transplanted, and observed in full dermis layer 8 weeks post cell transplantation.ConclusionDMSCs transplantation could obviously benefit to repair the damaged tissue of skin photoage.

Key words:dermal multipotential stem cells; skin photoage; transplantation; rats

皮膚光老化后引起皮膚粗糙、松弛、萎縮，出現(xiàn)皺紋和色素沉著，毛細血管擴張、紫癜甚至誘發(fā)皮膚癌，嚴重影響人類健康和美容[1]。光老化后皮膚組織中成纖維細胞的數(shù)量和質(zhì)量下降、膠原纖維和彈力纖維發(fā)生變性降解，導(dǎo)致皮膚不足以維持正常的組織構(gòu)建。目前所具有的治療手段均不能使這些病理變化得以有效逆轉(zhuǎn)。真皮多能干細胞(dermal multipotential stem cells，DMSCs)是存在于真皮組織中的一類具有高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，研究顯示，DMSCs可在一定條件下不僅可分化成纖維細胞，還能向成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)樣細胞轉(zhuǎn)化[2-3]，在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。但目前先有利用DMSCs治療組織損傷相關(guān)疾病的報道，本文旨在應(yīng)用光老化損傷大鼠模型觀察DMSCs對組織修復(fù)的影響。

1材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；DAPI、II膠原酶（sigma公司，美國）、FBS(Gibco公司，美國)；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、胰蛋白酶（Hyclone 公司，美國）；兔抗鼠波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體、CD34兔抗鼠多克隆抗體（Chemicon 公司，美國）；彈力纖維染色試劑盒、膠原纖維染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；15wUVA和UVB紫外燈（上海西格瑪電器有限公司）。

1.2 實驗動物：58只成年健康SD大鼠，雌雄各半，體重(210±20)g，第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號SCXKC（渝）2013-005。

1.3 DMSCs的分離培養(yǎng)[4]：取出生3天的SD乳鼠斷頸處死后，75%酒精浸泡5min，無菌剝離背部全層皮膚，以PBS液反復(fù)漂洗后，除去脂肪及皮下結(jié)締組織，將其剪成約5mm×5mm大小皮片，用0.5g/ml膠原酶于4℃條件下消化14～16h后，機械分離表皮和真皮，將真皮剪成1mm3大小的組織塊，加入0.25%胰蛋白酶于37℃條件下消化30min，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)300目鋼網(wǎng)過濾，收集濾液，1000rpm離心5 min，細胞沉淀懸浮于完全培養(yǎng)液（含DMEM、10ng/ml bFGF、10%FBS，100U/ml青霉素）中，調(diào)整細胞密度以2×105個/ml接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)6h后，更換新鮮培養(yǎng)基以去除未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng),每3天換液1次。

1.4DMSCs鑒定[5]：取原代培養(yǎng)的DMSCs，將細胞濃度調(diào)至1×105/ml接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，用完全培養(yǎng)基在37℃、 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，1天后細胞貼附于玻片后，取出爬片，通過形態(tài)學(xué)、CD34免疫熒光染色進行細胞鑒定。

1.5 實驗分組及皮膚光老化模型[6]制備：SD大鼠58只，分為正常對照組（8只），PBS對照組（25只）及DMSCs移植組（25只）。所有大鼠均剪除背部約5cm×5cm區(qū)域的毛發(fā),正常對照組不做任何處理。PBS對照組和DMSCs移植組則以15W UVA和UVB紫外燈并排置于大鼠背部裸露皮膚區(qū)正上方35cm處照射，每日2h，隔日剃除大鼠照射區(qū)新生毛發(fā)，觀察大鼠皮膚變化。連續(xù)照射60天后，各組隨即取死2只大鼠，行組織病理學(xué)檢測以確定模型制備成功。

1.6 DMSCs移植：制模成功后，取第三代DMSCs以0.05%胰酶消化制成細胞懸液，PBS洗滌兩次，重懸后用PBS調(diào)整細胞密度為1×106個/ml備用。DMSCs移植組在大鼠光老化皮膚的上下左右4個區(qū)域的真皮深層內(nèi)，用2ml注射器吸取1ml（1×106 個）細胞懸液直視注射，每個注射點間直徑為2cm，與邊緣間間隔為1cm，每點0.25ml。PBS對照組以同樣的方法注射等體積的PBS液。

1.7 組織學(xué)檢測：光老化造模成功后，各組分別取2只大鼠處死，取照射部位皮膚組織行膠原纖維染色（VG染色）和彈力纖維染色（Weigert染色）；DMSCs移植后4周、8周處死各組大鼠，取移植區(qū)2.5cm×2.5cm大小皮膚組織，常規(guī)固定包埋，連續(xù)切片（片厚約4μm），分別采用VG染色、Weigert染色及Vimentin免疫組織化學(xué)染色觀察組織膠原纖維、彈力纖維和成纖維細胞的改變。染色步驟如下：①VG染色：具體操作步驟照試劑盒說明書進行；組織切片常規(guī)脫蠟至水，分別滴加碘液、硫代硫酸鈉、流水沖洗后，滴加醛品紅染液、橙黃G染液，鏡下觀察控制染色時間，脫水、透明、封片；②Weigert染色：具體操作步驟照試劑盒說明書進行；切片脫蠟水化后，分別滴加蘇木素、三氯化鐵等量混合液、鹽酸分化后，滴加酸性品紅和苦味酸混合液染色5～10min，透明、封固后顯微鏡觀察；③Vimentin免疫組織化學(xué)染色：切片用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)后，5%山羊血清封閉30min，滴加兔抗鼠Vimentin（1:200）多克隆抗體，4℃過夜。二抗為生物素標記羊抗兔IgG，37℃孵育30min，PBS充分洗滌后再滴加SABC復(fù)合物室溫作用20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后觀察。以胞質(zhì)呈淡黃色者為陽性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1 大鼠皮膚光老化模型鑒定：大鼠裸露皮膚經(jīng)紫外燈照射后光老化區(qū)出現(xiàn)深大皺紋、變厚變硬、彈性差，毛發(fā)脫落，色素沉著等改變；VG染色見膠原纖維斷裂，明顯變性、均質(zhì)化，形成塊狀；Weigert染色彈性纖維增多、變粗、排列紊亂，部分區(qū)域聚集、纏結(jié)。

2.2 DMSCs形態(tài)及鑒定：DMSCs于培養(yǎng)12h后即可觀察到部分貼壁，貼壁的細胞大部分為多角形、橢圓形，72h后大部分貼壁細胞變?yōu)樗笮位蚨嘟切?，多呈集落樣生長；接種6～7天覆蓋面積達90%以上，細胞呈放射狀或漩渦狀排列；免疫熒光檢測結(jié)果顯示：DMSCs胞漿CD34表達陽性，呈明亮的綠色熒光，而不表達上皮細胞標志的CK19，提示該細胞為間質(zhì)來源，PBS替代一抗的空白對照未見陽性信號。

2.3 DMSCs移植后膠原纖維和彈力纖維的變化：VG染色結(jié)果顯示，DMSCs移植后4周，在損傷區(qū)域皮膚真皮層內(nèi)聚集、纏結(jié)的變性膠原纖維明顯減少，并見少量新生膠原（圖1C）；至第8周，延伸至皮下組織及真皮深層變性膠原纖維基本消失，出現(xiàn)大量深染、排列有序的新生膠原纖維，皮膚結(jié)構(gòu)層次清晰（圖1E）。Weigert染色結(jié)果顯示，在DMSCs移植組后第4周的真皮層內(nèi)，變性彈力纖維明顯減少（圖2C）；第8周則基本消失，組織形態(tài)接近正常（圖2E）；而對照組仍可見少量變性的彈力纖維分布于組織中（圖2F）。

2.4 DMSCs移植后成纖維細胞的變化：波形蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對照組相比，DMSCs局部多點注射后4周，移植組可見較多的成纖維細胞，主要分布于真皮淺層；治療第8周，仍有較多的成纖維細胞散在分布于真皮層；兩組間Vimentin染色光密度值具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）見表1。

3討論

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，皮膚組織真皮層內(nèi)存在一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞群即DMSCs，其體外培養(yǎng)呈現(xiàn)紡錘樣、長梭形生長形態(tài)，表達間充質(zhì)干細胞典型的表面標記，在一定實驗條件下具有促進脊髓神經(jīng)、軟骨缺損等組織修復(fù)的作用[7-8]，特別值得一提的是，DMSCs不僅縮短感染創(chuàng)面愈合時間，加速創(chuàng)面修復(fù)，還能促進創(chuàng)面皮膚神經(jīng)修復(fù)，在皮膚組織的創(chuàng)傷修復(fù)的治療中具有無可比擬的作用[9]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，DMSCs移植對于紫外線誘導(dǎo)的光老化皮膚模型大鼠具有良好的治療作用，但DMSCs移植對光老化皮膚真皮組織內(nèi)部的病損改變的影響卻不得而知。本實驗結(jié)果顯示，無論是變性的膠原纖維還是彈力纖維，DMSCs移植后均得以有效的清除，同時筆者還發(fā)現(xiàn)有較多膠原纖維新生。膠原纖維是人體皮膚中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是含量最豐富的蛋白質(zhì)。在真皮中聚集成與皮面平行的粗大纖維束，相互交織成網(wǎng)，是維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，也是維持皮膚飽滿充盈的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，紫外線照射導(dǎo)致彈力纖維變性，引起異常的、無定形的彈力纖維變性物質(zhì)在真皮層沉淀，并取代正常的膠原纖維和彈力纖維，使皮膚失去彈性，血管壁變薄，變脆等改變更是皮膚光老化病損改變的病理基礎(chǔ)。此種病理轉(zhuǎn)變對維持病損后皮膚組織的外觀形態(tài)至關(guān)重要。

實驗中筆者還觀察到DMSCs移植后真皮層內(nèi)成纖維細胞明顯多于對照組，說明DMSCs移植可有效延緩皮膚真皮層內(nèi)成纖維細胞的損傷。成纖維細胞是真皮組織中最重要細胞組分，主要合成分泌膠原纖維、彈力纖維，蛋白多糖等基質(zhì)。所以筆者大膽推測，DMSCs移植后成纖維細胞的有效存活和功能再生是DMSCs移植治療皮膚光老化的重要機制之一，然而DMSCs通過何種途徑維持成纖維細胞的數(shù)量及功能，有待進一步深入研究。

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[收稿日期]2014-03-02[修回日期]2014-04-03

編輯/張惠娟