錢衛(wèi)東 寧肖肖 趙德志等

摘要[目的]提高多形漢遜酵母發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇的產量。[方法]通過正交試驗確定了用多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分，進而結合培養(yǎng)溫度對發(fā)酵過程的影響，獲得運用變溫策略提高多形漢遜酵母生產D阿拉伯糖醇的方法。[結果]最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉12 g/L，Triton X100 10 g/L，硫酸銨3.0 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L；多形漢遜酵母DL1的最適生長溫度和D阿拉伯糖醇最適合成溫度分別為37 ℃和34 ℃；變溫調控發(fā)酵方法為：將發(fā)酵培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)24 h后，升溫到48 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再降溫至34 ℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h得到發(fā)酵液。采用該方法發(fā)酵結束后D阿拉伯糖醇產量為114.92 g/L，比恒溫發(fā)酵（37 ℃、48 ℃、34 ℃）分別提高了30.25%、208.66%、20.93%。[結論]該方法可以提高多形漢遜酵母發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇。

關鍵詞 D阿拉伯糖醇，多形漢遜酵母DL1，正交試驗，變溫調控

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07726-03

基金項目國家自然科學基金項目“利用超遠緣遺傳轉化酵母技術解析龍膽苦苷生物合成關鍵酶基因”（31100040）；陜西省教育廳項目“利用酵母全合成抗癌藥物紫杉醇的研究（2013JK0727）”。

作者簡介錢衛(wèi)東（1980-），男，安徽蕪湖人，講師，博士，從事功能性酵母開發(fā)方面的研究。

收稿日期20140710D阿拉伯糖醇是一種五碳多元糖醇，在機體內的代謝與胰島素無關，是一種重要的功能性食品基料[1]。目前的主要生產方法有提取法、化學合成法及生物法[2]。

生物法具有成本低，易于操作，節(jié)能環(huán)保等特點。發(fā)酵法生產D阿拉伯糖醇常用的菌株一般都是耐高滲酵母。耐高滲酵母在高滲環(huán)境中能夠代謝產生多元糖醇，保護高滲條件下的細胞[3]。目前用于生產D阿拉伯糖醇的主要菌株有漢遜酵母屬（Hansenula）[4]、畢赤酵母屬（Pichia）[5]、假絲酵母屬（Candida）[6]、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）[7]、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）[8]。宋衛(wèi)斌[9]從花粉中篩選獲得了1株D阿拉伯糖醇產量為86.55 g/L的高產菌株，分析鑒定屬于假絲酵母屬。唐曉芳等[10]對Hansenula anomala轉化葡萄糖生產D阿拉伯糖醇的反應條件進行了研究，在最佳工藝條件下D阿拉伯糖醇濃度為245.97 g/L，轉化率為0.49 g阿拉伯糖醇/g葡萄糖。李澤[11]從高滲環(huán)境中篩選出1株D阿拉伯糖醇的高產菌株，并對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，在最佳工藝條件下進行發(fā)酵，D阿拉伯醇的產量能達到60.6 g/L，葡萄糖轉化率為 26.11%。蔡利等[12]從高糖環(huán)境中篩選出一株D阿拉伯糖醇產量為54.65 g/L的高產菌株，命名為Kodamaea ohmeri NH9。尤翠萍等[13]研究了表面活性劑對得巴利漢遜酵母發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇的影響，結果發(fā)現(xiàn)，Triton X-100對D阿拉伯糖醇的生產具有顯著的促進作用。

漢遜酵母屬中的多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）是當前國際公認的理想細胞工廠之一[14]。多形漢遜酵母DL1是一種耐熱酵母（可在49 ℃條件下正常生長），培養(yǎng)溫度較高，細胞生長代謝速度較快，相對較高的培養(yǎng)溫度有利于降低冷卻成本和大規(guī)模培養(yǎng)時的污染可能性。多形漢遜酵母可以在廉價的非選擇性培養(yǎng)基中生長，易于高密度發(fā)酵，具有廣泛的研究價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種。多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha，H.polymorpha）DL1（ATCC No.26012）菌株，由中國科學院微生物研究所邱并生研究員惠贈；陜西科技大學制藥工程實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 ，pH 6.0。

高滲固體培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。

1.2試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。

1.2.1.1菌株預培養(yǎng)。 將斜面保藏的種子在37 ℃活化3 h后，挑取一個單菌落接種至裝有5 ml種子培養(yǎng)基的試管，37 ℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h得種子液。將培養(yǎng)好的種子液涂布于葡萄糖含量為500 g/L的高滲固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h；挑取生長較好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，37 ℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h得種子液。重復此步驟馴化3次后，挑選生長較大的單菌落涂布在高滲固體斜面保藏。

1.2.1.2種子培養(yǎng)。 將馴化后的種子在37 ℃活化3 h后，挑取一個單菌落接種至裝有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中進行種子培養(yǎng)，37 ℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h得種子液。

1.2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。以葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、Triton X100、硫酸銨、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀的添加量為考察因素，根據文獻報道設置不同水平，運用正交試驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。在溫度37 ℃、接種菌齡24 h、接種量5%、搖床轉速160 r/min、發(fā)酵時間144 h的條件下，進行7因素3水平正交試驗設計，具體設計見。發(fā)酵結果經極差和方差分析，找出各培養(yǎng)基成分的最佳濃度。

正交試驗設計g/L

水平因素葡萄糖（A）蛋白胨（B） 酵母浸粉（C） Triton X-100（D） 硫酸銨（E）七水硫酸鎂（F）磷酸二氫鉀（G）115018863.02.52.522002010103.53.03.032502212144.03.53.5

1.2.1.4 變溫發(fā)酵培養(yǎng)。 將發(fā)酵培養(yǎng)基在37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，升溫到48 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再降溫到34 ℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h得發(fā)酵液，每隔24 h取樣分析。每組試驗設計3組平行對照，取試驗結果的平均值。

1.2.2 分析測定方法。

1.2.2.1 細胞干重測定。 將10 ml發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min后用蒸餾水洗滌2次得到的細胞在80 ℃下烘至恒重，稱重。

1.2.2.2 D阿拉伯糖醇產量和葡萄糖殘留量的測定。 取新鮮發(fā)酵液50 ml，8 000 r/min離心10 min，取上清，用微孔濾膜過濾。檢測條件：色譜柱SH1011；柱溫50 ℃；進樣量5 μl；流動相0.01 mol/L H2SO4；流速0.8 ml/ min；示差檢測器，根據保留時間分析D阿拉伯糖醇產物和葡萄糖底物的濃度。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化分析結果見和3。由可知，各因素的極差順序為RA>RD>RB>RF>RC>RG>RE，極差R值越大，其對D阿拉伯糖醇產率影響越大。因此，影響因子的先后順序為：葡萄糖>Triton X100>蛋白胨>七水硫酸鎂> 酵母浸粉>磷酸二氫鉀>硫酸銨。方差分析結果進一步表明，A（葡萄糖）和D（Triton X100）對D阿拉伯糖醇的產率有顯著影響。用多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為A2B2C3D2E1F1G1，即葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉12 g/L，聚乙二醇辛基苯基醚10 g/L，硫酸銨3.0 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L；依照此發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行發(fā)酵驗證試驗，D阿拉伯糖醇產率可達91.46 g/L。

2.2溫度對D阿拉伯糖醇產量的影響

2.2.1 恒溫發(fā)酵。溫度是影響微生物細胞生長以及代謝產物合成的一個重要因素。在發(fā)酵前期，溫度通過影響培養(yǎng)基的性質進而影響微生物菌體自身的生長；在發(fā)酵中后期，溫度通過影響目標產物生物合成關鍵酶的活性進而調控代謝產物的合成。因此在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，必須保證合適的溫度。多形漢遜酵母DL1的最適生長溫度是37～43 ℃，最高生長溫度可達49 ℃。設置不同溫度（30、34、37、40、44、48 ℃）條件下恒溫發(fā)酵144 h，每隔8 h取樣測定菌體生物量及D阿拉伯糖醇產量，以期獲得該菌最適的發(fā)酵溫度，結果見。

正交試驗結果

試驗

從可以看出，溫度對菌體生物量及D阿拉伯糖醇含量有明顯的影響。由a可知，培養(yǎng)溫度為37 ℃時，細胞生長速率顯著增大，40 h菌體開始進入穩(wěn)定期，細胞干重（DCW）達到最大值（5.32 g/L）；當培養(yǎng)溫度為48 ℃時，細胞生長緩慢，延滯期較長。由b可知，培養(yǎng)溫度為34 ℃時，D阿拉伯糖醇生成速率最大，發(fā)酵結束后D阿拉伯糖醇總量達到95.03 g/L。

溫度對菌體生物量和D阿拉伯糖醇產量的影響2.2.2 變溫發(fā)酵。 從上述試驗可以看出，多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇過程中，菌體生長和D阿拉伯糖醇生產的最適溫度不同。同時，D阿拉伯糖醇是一種多元糖醇，在抵御高溫條件引起的刺激中起著非常重要的作用。因此該試驗運用變溫控制以滿足細胞生長、D阿拉伯糖醇合成以及產生的D阿拉伯糖醇保護機體自身的作用3方面的要求，以提高細胞反應過程中目標產物的量，結果見。

變溫調控對D阿拉伯糖醇產量和菌體生物量的影響由可知，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，升溫到48 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再降溫至34 ℃繼續(xù)發(fā)酵96 h，細胞干重和D阿拉伯糖醇產量分別為5.26 g/L和114.92 g/L。細胞干重相比37 ℃（5.32 g/L）和34 ℃（5.09g/L）變化不明顯；但相比于48 ℃恒溫發(fā)酵（3.21 g/L）提高了2.09倍。D阿拉伯糖醇產量相比37 ℃恒溫發(fā)酵（88.23 g/L）、48 ℃恒溫發(fā)酵（37.23 g/L）和34 ℃恒溫發(fā)酵（95.03 g/L）分別提高了30.25%、208.66%、20.93%。這表明，變溫發(fā)酵培養(yǎng)可以影響菌體細胞的生長和代謝產物的生成，適時的高溫刺激可以促使菌體大量合成D阿拉伯糖醇，以應對外界不良環(huán)境的變化，達到自我保護的目的。

3 結論

通過對多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇過程的初步研究，根據溫度對微生物細胞生長和產物代謝過程的影響，結合細胞生長的最適溫度、產物生成的最適溫度以及發(fā)酵培養(yǎng)基組分的影響，獲得了一種提高多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇產量的方法，采用該方法發(fā)酵結束后細胞干重和D阿拉伯糖醇產量分別為5.26 g/L和114.92 g/L。D阿拉伯糖醇產量分別比恒溫發(fā)酵（37、48、34 ℃）提高了30.25%、208.66%、20.93%；細胞干重相比37 ℃恒溫發(fā)酵和34 ℃恒溫發(fā)酵變化不明顯，相比于48 ℃恒溫發(fā)酵提高了2.09倍。該研究提供的方法為利用多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產D阿拉伯糖醇提供實踐依據。

安徽農業(yè)科學2014年參考文獻

[1] 金樹人，李瑛，夏桂珍，等.糖醇生產技術與應用[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2008.

[2] JAVIER ESCALANTE，GLORIA CAMINAL，MARTA FIGUEREDO，et al.Production of Arabitol from Glucose by Hansenula polymorpha[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1990，70（4）：228-231.

[3] TOKUOKA K.Sugarand salttolerant yeasts[J].The Journal of Applied Bacteriology，1993，74：101-110.

[4] ESCALANTE J，CAMINAL G， FIGUEREDO M，et al.Production of arabitol from glucose by Hansenula PolymorPha[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1990，70：228-231.

[5] FUJIWARA A，MASUDA S.Process for Producing Darabitol：US，4271268[P].1981.

[6] BERNARD E M， CHRISTIANSEN K J， TSANG S F，et al.Rate of Arabinitol Production by pathogenic yeast species[J].Journal of Clinical Microbiology，1981，14：189-194.

[7] ONISHI H，SUZUKI T.Microbial Production of xylitol from glucose[J].Applied Microbiology，1969，18（6）：1031-1035.

[8] SAHA B C，SAKAKIBARA Y.Production of Darabitol by a newly isolated Zygosaccharomyces rouxii[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2007，34：519-523.

[9] 宋衛(wèi)斌.D阿拉伯醇生產菌的選育、工藝優(yōu)化及其關鍵酶基因的克隆、表達[D].杭州：浙江大學，2011.

[10] 唐曉芳，張國棟，王剛. Hansenola anomala轉化葡萄糖生產阿拉伯糖醇的研究[J].食品工業(yè)科技，2012（1）：314-317.

[11] 李澤.產D阿拉伯醇酵母菌株的篩選及發(fā)酵條件研究[D].濟南：山東輕工業(yè)學院，2012.

[12] 蔡莉，張揚，朱宏陽，等.一株產D阿拉伯糖醇的菌株的分離篩選及鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（1）：23-26.

[13] 尤翠萍，張梁，丁重陽，等.表面活性劑對D阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響[J].生物加工過程，2011，9（2）：18-22.

[14] GELLISSEN G.Heterologous protein production in methylotrophic yeasts[J].Applied Microbiol Bitechnol，2000，54：741-750.安徽農業(yè)科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（23）：