李佳琪等

摘要：本文綜合敘述了篩選高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的常用方法和分離純化胞外多糖的多種途徑。采用哪些方法取決于原材料、菌株特性及培養(yǎng)基類型，同時(shí)這些方法也決定著分離胞外多糖的精確度及純度。因此，本文旨在通過對(duì)比這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為提取高純度的乳酸菌胞外多糖提供參考，并為進(jìn)一步進(jìn)行胞外多糖的結(jié)構(gòu)鑒定奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：乳酸菌 胞外多糖 分離篩選 方法

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）06-0001-03

1 引言

乳酸菌，是一類無芽孢、革蘭氏染色為陽性的異養(yǎng)厭氧型原核細(xì)菌，能夠發(fā)酵糖類，產(chǎn)物主要為乳酸（辨別的主要標(biāo)志），其形態(tài)多樣主要以鏈狀和桿狀存在。乳酸菌對(duì)人體有諸多益處，比如乳酸菌在生長過程中消耗乳酸對(duì)預(yù)防和治療乳糖不耐癥有良好的作用；同時(shí)發(fā)酵的產(chǎn)物可以促進(jìn)鈣、鎂離子及蛋白質(zhì)、單糖等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；還可以產(chǎn)生B族維生素等大量有益物質(zhì)；另外，乳酸菌的生長可以增加腸道的益生菌群，進(jìn)一步改善人體胃腸道功能，保持人體腸道內(nèi)菌群平衡，維護(hù)人體健康；也可以抑制腐敗菌的繁殖；同時(shí)消解腐敗菌產(chǎn)生的毒素，清除腸道垃圾；代謝產(chǎn)物還可以抑制膽固醇吸收，有降血脂、降血壓作用；亦可以提高SOD酶活力，消除人體自由基，具有抗衰老、延年益壽作用。此外，還有一些報(bào)道認(rèn)為乳酸菌能有效的預(yù)防女性泌尿生殖系統(tǒng)細(xì)菌感染，還能控制人體內(nèi)毒素水平，保護(hù)肝臟并有助于增強(qiáng)肝臟的解毒、排毒功能。總之，乳酸菌現(xiàn)在是備受矚目，前景廣闊。

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是由細(xì)菌及少數(shù)酵母菌和絲狀真菌在生長的過程中產(chǎn)生的。微生物產(chǎn)生的EPS可以在自然環(huán)境中起到保護(hù)微生物細(xì)胞的作用，比如使細(xì)胞避免因干燥而引起脫水、防止被噬菌體侵染，同時(shí)還可維持細(xì)胞的滲透壓，并且參與到細(xì)胞的信息傳遞和細(xì)胞的構(gòu)成等作用。自從通過腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostc mesenteroides subsp. mesenteroides）的發(fā)酵生產(chǎn)出右旋糖酐以來，乳酸菌胞外多糖的開發(fā)與應(yīng)用便引起了諸多研究人員的關(guān)注，已變成了一個(gè)重大的研究熱點(diǎn)[1]。

乳酸菌EPS是乳桿菌諸多菌屬中多種乳酸細(xì)菌在特定環(huán)境下分泌到細(xì)胞壁外的黏液或莢膜多糖（capsular polysaccharide）。乳酸菌EPS的作用很多，在酸乳形成方面，對(duì)其質(zhì)構(gòu)與風(fēng)味，產(chǎn)生特有的營養(yǎng)價(jià)值方面有極為重要的作用與影響，它可以增加酸奶的黏度，提高酸奶穩(wěn)定性和保水性，使產(chǎn)品具有良好的口感、質(zhì)地和風(fēng)味。又因?yàn)槿樗峋鶨PS具有安全無毒的特性，所以在食品工業(yè)中作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、膠凝劑及保濕劑而被廣泛的應(yīng)用。通過研究，部分乳酸菌EPS還具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降低血糖、增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)胃腸功能、降血清膽固醇等多種生理功能，因此將其開發(fā)為功能性食品具有廣闊的推廣前景。

本文綜合闡述拉近幾年有關(guān)乳酸菌EPS分離純化實(shí)驗(yàn)的研究報(bào)道，總結(jié)分析一些分離純化的手段并說明其優(yōu)缺點(diǎn)，旨在找到高效的分離純化方法，為化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能的鑒定試驗(yàn)提供純度保證，為進(jìn)一步研究EPS的分子結(jié)構(gòu)、生理功能與分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)[2]。

2 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選方法

2.1 MRS-溴甲酚紫平板篩選法

MRS-溴甲酚紫平板篩選法是指將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖用2%的蔗糖代替，加入0.05%的溴甲酚紫配成MRS-溴甲酚紫培養(yǎng)基，利用劃線法進(jìn)行菌種的分離培養(yǎng)。在MRS-溴甲酚紫平板上產(chǎn)黏并能使溴甲酚紫變黃的菌落，即為產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌落。MRS-溴甲酚紫平板篩選法是一種簡(jiǎn)單、可行性高的初步篩選方法。

2.2 拉絲法和黏度測(cè)量

一般產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌落表面光滑，具有拉絲現(xiàn)象，因此只需用無菌牙簽接觸菌落，輕輕地向外拉，在培養(yǎng)基表面形成連續(xù)的拉絲，即該菌落可以產(chǎn)胞外多糖。因此，菌落拉絲法是一種簡(jiǎn)便而有效的產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌篩選方法，可用于廣泛篩選。但是該方法有局限性，各別乳酸菌菌株是否產(chǎn)生黏性菌落取決于培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。對(duì)于產(chǎn)黏性菌落的菌株來說，產(chǎn)生黏性菌落亦有遺傳不穩(wěn)定性，傳代培養(yǎng)數(shù)代后會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)非黏性菌落的變異。但是，失去產(chǎn)黏性菌落的特性不會(huì)影響發(fā)酵乳制品的質(zhì)量，因此可將乳酸菌接種于脫脂乳中培養(yǎng)，通過采用黏度儀測(cè)量酸奶的黏度來判斷是否產(chǎn)生胞外多糖[3]。

2.3 染色法及顯微鏡鏡檢法

該法多用于莢膜多糖的檢測(cè)。由于莢膜多糖緊密地包裹在菌體細(xì)胞壁外又不易著色，因此采用墨汁染色鏡檢時(shí)，菌體外出現(xiàn)透明光圈。分子量較小的EPS產(chǎn)量少時(shí)可能附著在細(xì)胞壁外出現(xiàn)此現(xiàn)象。近年來，激光共聚焦顯微鏡（CSLM）技術(shù)已用于觀察產(chǎn)EPS菌株發(fā)酵的乳制品微觀結(jié)構(gòu)。該方法中可用伴刀豆蛋白A 488對(duì)EPS進(jìn)行染色，然后用CSLM直接觀察到乳制品中的EPS[4]。

2.4 液體培養(yǎng)基檢測(cè)法

由于產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的來源不只局限在乳制品中，各類乳酸菌發(fā)酵制品均可作為篩選高產(chǎn)EPS的原材料。因此，將分離后的乳酸菌在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行EPS檢測(cè)的方法最常見。其中，不同研究者采用了不同的培養(yǎng)基。Van GeelSchutten等人（1998）采用含有高濃度碳水化合物的MRS培養(yǎng)基來篩選產(chǎn)EPS乳酸菌，并嘗試了不同碳源，結(jié)果表明含蔗糖培養(yǎng)基是檢測(cè)產(chǎn)EPS現(xiàn)象的最好選擇。但是，之后也有不同報(bào)道認(rèn)為，各別含葡萄糖或半乳糖的培養(yǎng)基中EPS產(chǎn)量最高。這些差異可能是與合成EPS的酶系有關(guān)，對(duì)于eps基因簇的分子組成及EPS合成酶相關(guān)的研究進(jìn)展可能有助于解釋這些現(xiàn)象。

3 乳酸菌胞外多糖的分離純化方法

3.1 胞外多糖的分離提取方法

通常，分離提取EPS的方法難易程度取決于培養(yǎng)乳酸菌菌株所使用的培養(yǎng)基成分。最簡(jiǎn)單的步驟是將培養(yǎng)液離心去除菌體后采用乙醇沉淀法收集沉淀，冷凍干燥后對(duì)水透析分離提取EPS。

乙醇沉淀法是指向得到的上清液中加入3～5倍體積的95%乙醇，4℃冷藏過夜，使多糖呈絮狀沉淀析出，然后在溫度為4℃下離心，收集沉淀即為乳酸菌的胞外多糖[6]。透析法是指將乙醇沉淀物用少量蒸餾水復(fù)溶后裝入透析袋，在4℃的條件下，于蒸餾水中透析48h，每隔4～6小時(shí)換一次水，即可得到較純的EPS水溶液[8]。該方法可根據(jù)透析袋的截留分子量有效去除一些小分子物質(zhì)及鹽類等雜質(zhì)。也可先將乳酸菌發(fā)酵液裝入透析袋中進(jìn)行透析，然后再使用乙醇沉淀法得到胞外多糖[7]。也有研究者利用丙酮沉淀法，但目前乙醇沉淀仍是乳酸菌EPS分離純化中非常常用的手段，因?yàn)橐掖疾粌H價(jià)格便宜，而且使得胞外多糖沉淀完全。

培養(yǎng)基成分中蛋白質(zhì)含量較多時(shí)（如脫脂乳培養(yǎng)基、乳清培養(yǎng)基等），需要采用另外的純化步驟降低EPS沉淀中的蛋白質(zhì)含量。目前常用的除蛋白的方法主要有三種：

3.1.1 Sevage法除蛋白

Sevage法首先是將氯仿和正丁醇按一定（4：1或5：1）比例配制成Sevage液待用，然后將粗品EPS復(fù)溶后，加入1/3體積的sevage液，振蕩、離心、去除沉淀，重復(fù)三次，即可除去粗品EPS中的蛋白。此法可避免EPS降解，減少EPS損失，但脫除蛋白質(zhì)的效率不高。但如果與酶解法相結(jié)合，除蛋白效果將會(huì)有所提高。

3.1.2 酶解法

用飽和NaOH溶液將粗品EPS溶液pH調(diào)至8.0后離心，取上清液再用HCL調(diào)節(jié)pH至4.6后離心，接下來調(diào)節(jié)pH至7.5，加入現(xiàn)配的濃度為3g/L的胰酶液，然后水浴、離心。此法的缺點(diǎn)在于會(huì)有酶蛋白殘留。不過，再結(jié)合使用sevage法，可以改善除蛋白的效果[4]。另外，也有使用鏈霉蛋白酶E的報(bào)道。

3.1.3 三氯乙酸法

三氯乙酸法是指取37℃下培養(yǎng)24h的乳酸菌EPS 發(fā)酵液，向其中滴加三氯乙酸（終濃度至4～14%），充分振蕩后離心去沉淀，或先將乳酸菌EPS發(fā)酵液經(jīng)離心后取上清液，在上清液中加入三氯乙酸，4℃靜置過夜，最后離心以脫除蛋白質(zhì)[5]。這種方法除去蛋白質(zhì)的效果較好，在實(shí)驗(yàn)中使用廣泛，但缺點(diǎn)是會(huì)使某些EPS發(fā)生降解，造成損失。劉慧等人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，若在實(shí)驗(yàn)中提高三氯乙酸的pH值或低溫下處理乳酸菌EPS發(fā)酵液，都可以減少EPS的降解。如果酶解法和三氯乙酸法相結(jié)合，不僅可以徹底除去蛋白質(zhì)，減少EPS的降解，而且可以除去酶解后殘留的酶蛋白，是目前相對(duì)較好的除蛋白的方法。

此外，還有三氟三氯乙烷法。它是指向乳酸菌EPS發(fā)酵液中以1：1的體積加入三氟三氯乙烷，在低溫下攪拌10min左右，離心后取上層水液，重復(fù)上述處理方法數(shù)次，即可得到除去蛋白的EPS溶液。這種方法效率較高，但是殘留的溶劑存在危險(xiǎn)，現(xiàn)在基本不使用。

3.2 乳酸菌胞外多糖的純化方法

除了沉淀EPS和去除蛋白質(zhì)外，還需要其他步驟進(jìn)一步純化提取到的粗品EPS，用于進(jìn)行特性分析、結(jié)構(gòu)鑒定等要求高純度的試驗(yàn)研究。這些方法包括，超濾法、薄層層析層析法和柱層析法。

3.2.1 超濾法

超濾法是一種膜分離技術(shù)，利用不同截留分子量的超濾膜分離裝置進(jìn)行多糖的進(jìn)一步分級(jí)純化，在應(yīng)用于對(duì)多糖的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，不僅可以濃縮澄清的多糖，還可分離發(fā)酵液中殘余的培養(yǎng)基組分，如糖、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽等。該方法對(duì)儀器設(shè)備要求高，但是有操作方便、能耗低、效率高、條件溫和、破壞小等許多優(yōu)點(diǎn)，并且得到的純度和回收率均高于傳統(tǒng)方法提取的多糖，對(duì)于分子量相對(duì)較大、溶液黏度大且不穩(wěn)定的多糖來說是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ姆蛛x手段，目前相關(guān)報(bào)道較少，但將來必將得到廣泛應(yīng)用[9]。

3.2.2 柱層析法

柱層析法是純化活性的EPS常用方法，具體的有纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析等。柱層析法是考慮乳酸菌EPS自身一些特點(diǎn)的一種方便、快捷的純化方法。但是運(yùn)用柱層析方法是需要注意：①純化柱的選擇：純化柱的長度對(duì)分辨率有較大影響，且其長短與分辨率成正比，但是長度不宜太長，否則會(huì)引起柱子的不均一。②填料的選擇：填料選擇時(shí)要考慮純化EPS的分子量、黏稠度及填料本身的顆粒大小等條件。一般根據(jù)多糖樣品的情況確定一個(gè)合適的分離范圍，再根據(jù)分離范圍選擇合適的凝膠。③填料的溶脹：保證樣品的均一性。④裝柱：裝柱時(shí)注意干濕法的選擇。干法裝柱速度快，溶劑消耗少，但分辨率較低、柱效差，比較適合大量樣品的初步分離純化；而濕法裝柱的柱效較高，適合純化研究用的少量樣品。⑤洗脫速度與流速：一般洗脫速度恒定、流速適當(dāng)，可使樣品與凝膠填料基質(zhì)充分平衡，分離效果好。洗脫速度慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，從而降低分辨率、大大延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

4 乳酸菌胞外多糖的測(cè)定方法

經(jīng)過分離純化后，采用冷凍干燥可得到EPS干粉，其重量可作為檢測(cè)EPS產(chǎn)量的最簡(jiǎn)單的方法。但該方法的準(zhǔn)確度取決于純化程度，有可能包括了部分蛋白質(zhì)或非EPS碳水化合物成分。因此，傳統(tǒng)的顯色方法（如苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法等）以及現(xiàn)在儀器檢測(cè)法（如高效液相色譜法）較常用。

4.1 苯酚硫酸法

苯酚硫酸法是目前最常用也是技術(shù)非常成熟的多糖測(cè)定方法。該方法的關(guān)鍵之處在于需要預(yù)先用已知濃度的葡萄糖溶液繪制出以葡萄糖密度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。再用硫酸—苯酚法測(cè)得 EPS水溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的糖含量，即得乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量。這種方法操作簡(jiǎn)單、靈敏性高、反應(yīng)快速、重復(fù)性好，廣泛應(yīng)用于不同方法提取到的EPS產(chǎn)量測(cè)定，是EPS含量測(cè)定是常用的一種方法[10]。

4.2 色譜法

目前，在色譜法中高效液相色譜法（HPLC法）是最常用的一種方法。利用HPLC法不僅可以克服苯酚—硫酸法的繁瑣操作，而且也可以避免因其他方法造成的雜質(zhì)殘留而引起的結(jié)果偏高。但是HPLC法對(duì)設(shè)備要求高，還要求有專一的糖和氨基柱。

利用HPLC法測(cè)乳酸菌胞外多糖時(shí)，首先需要配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：用純凈水將2g干燥且恒重的木糖、葡萄糖、果糖分別定容與50ml容量瓶中；其次需要配制標(biāo)準(zhǔn)使用液：用移液管分別吸取1ml、2ml、3ml、5ml上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用重蒸餾水定容與10ml容量瓶中，經(jīng)0.22μm微孔過濾后備用；然后將20.00mg胞外多糖樣品溶于20ml的2.0mol/L硫酸中，沸水浴水解8h，用BaCO3中和至中性，經(jīng)0.22μm微孔過濾后備用；最后裝樣、測(cè)定。若為純品在色譜柱中洗脫后得到單一對(duì)稱峰，電泳后得到單一斑點(diǎn)[11]。

除了高效液相色譜法外，氣相色譜法也是經(jīng)常使用的手段之一。雖然氣相色譜法廣泛應(yīng)用于生物材料中單糖組分和生物高聚物結(jié)構(gòu)的研究，但是微生物產(chǎn)生的胞外多糖的單糖組分差異很大，糖類是一種揮發(fā)性較差的化合物，在用氣相色譜法分析各種單糖時(shí)，必須先將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性衍生物。所以，盡管色譜法現(xiàn)在正在被廣泛認(rèn)可與贊許，但是因其設(shè)備費(fèi)用昂貴又要求設(shè)備的高精準(zhǔn)度，其在胞外多糖的測(cè)定上仍然有待進(jìn)一步更完善的發(fā)展。

根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)材料不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，研究者們采用不同胞外多糖純化和檢測(cè)策略，本文將近幾年內(nèi)代表性文章中使用的方法進(jìn)行了匯總（見表1）。

5 展望

近些年隨著人們愈加關(guān)注天然、健康的產(chǎn)品，乳酸菌EPS也同樣進(jìn)入了大眾的視線內(nèi)，并且其分離純化也已經(jīng)備受關(guān)注，特別是以乳酸菌EPS結(jié)構(gòu)鑒定為基礎(chǔ)，進(jìn)而分離純化，具體方法可依據(jù)乳酸菌EPS的性質(zhì)及其共存的組成成分來決定。雖然分離乳酸菌EPS的各種方法各有不同，條件亦比較成熟，但是高產(chǎn)菌株較難選取，所以乳酸菌EPS的提取率并不高，而且乳酸菌EPS分離純化方法的滯后，影響和制約了乳酸菌EPS的研究與產(chǎn)品的工業(yè)化。因此，未來必須改進(jìn)EPS分離純化方法，優(yōu)化工藝以提高提取率與純度，為EPS分子結(jié)構(gòu)、生理功能與分子作用機(jī)制的進(jìn)一步研究及其產(chǎn)品的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

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