賀燕林，楊中林

(中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京210009)

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陳皮不同提取物及橙皮苷部位的抗炎活性比較研究

賀燕林，楊中林*

(中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京210009)

目的：比較研究陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性。方法：用1μg/mL的脂多糖(LPS)處理RAW264.7細胞，建立炎癥模型，采用NO試劑盒檢測各實驗樣品對模型細胞NO釋放量的影響；采用MTT法測定細胞活力。結(jié)果及結(jié)論：陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位均具有顯著抗炎活性，且陳皮醇提物、陳皮水提物的抗炎活性優(yōu)于橙皮苷部位。

陳皮醇提物；陳皮水提物；橙皮苷部位；抗炎

陳皮(Pericarpium Citri Reticulatae)為蕓香科植物橘(CitursreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，主要含有黃酮、類檸檬苦素、揮發(fā)油等化學成分。黃酮類成分包括：橙皮苷、新陳皮苷、柑橘素等，其中橙皮苷為主要成分[1]。《中國藥典》記載陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰等作用，臨床主要用于胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[2]。目前對于陳皮抗炎作用的研究很少，本次實驗采用LPS誘導RAW264.7細胞建立炎癥模型[3]，以模型細胞NO釋放量為指標，比較研究陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性，為進一步開發(fā)利用中藥陳皮提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞

RAW264.7細胞(中國藥科大學新藥篩選中心惠贈)。

1.2 試藥與試劑

陳皮飲片(產(chǎn)地江蘇，購自先聲藥店，經(jīng)本人鑒定為蕓香科植物橘CitursreticulataBlanco的干燥成熟果皮)；95%乙醇(分析純，南京鼎新化工輕工有限公司)；脂多糖(Sigma公司)；一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；二甲亞砜(分析純，南京化學試劑有限公司)；四氮甲唑藍(南京化學試劑有限公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

0412-1型低速離心機(上海醫(yī)療器械有限公司)；BS124型電子天平(Sartorius Corporation，Germany)；超凈工作臺(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)；HERA Cell 150型恒溫培養(yǎng)箱(Kendro Laboratory Products，Germany)；RT-6000型酶標分析儀(深圳書社生命科學股份有限公司)；HH-4型恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；COICXDS-1B型倒置光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；YXQ·SG41·280型電熱手提壓力蒸汽消毒器(上海醫(yī)用核子儀器廠)；79-1型磁力攪拌器(深圳國華儀器有限公司)；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Corstar Corporation，USA)。

2 實驗方法

2.1 陳皮醇提物、陳皮水提物、橙皮苷部位制備

2.1.1 陳皮醇提物制備 準確稱取12.2g陳皮飲片置250mL圓底燒瓶中，溶媒為80%乙醇溶液，浸泡2h。共提取3次，第1次用10倍量溶媒提取2h，第2次用10倍量溶媒提取1h，第3次用10倍量溶媒提取1h，提取液8層紗布過濾后合并，減壓濃縮至無醇味，再將藥液置于水浴鍋上揮去水分(90℃)，真空干燥箱中干燥至衡重，得陳皮醇提物4.4g。陳皮醇提物得率=醇提物稱量/藥材稱量×100%=4.4g/12.2g×100%=36.1%。

2.1.2 陳皮水提物制備 準確稱取12.2g陳皮飲片置250mL圓底燒瓶中，溶媒為水，浸泡2h。共提取3次，第1次用10倍量溶媒提取2h，第2次用10倍量溶媒提取1h，第3次用10倍量溶媒提取1h，提取液8層紗布過濾后合并，將藥液置于水浴鍋上揮去水分(90℃)，真空干燥箱中干燥至衡重，得陳皮水提物4.9g，陳皮水提物得率=水提物稱量/藥材稱量×100%=4.9g/12.2g×100%=40.1%。

2.1.3 橙皮苷部位制備 實驗室前期采用醇提水沉等方法分離純化制備，藥材中該部位的得率為7%。經(jīng)HPLC法測定，該部位中陳皮苷含量為45.90%。

2.2 試藥配制

2.2.1 LPS造模劑溶液的配制 用十萬分之一電子天平精密稱取LPS粉末1mg置于1.5mL離心管中，加入DMEM高糖培養(yǎng)基1mL，震蕩溶解。精密吸取0.1mL上述LPS溶液于15mL離心管中，加入9mL DMEM高糖培養(yǎng)基，混合均勻，得濃度為10μg/mL的LPS溶液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 陳皮醇提物溶液配制 用十萬分之一電子天平精密稱取陳皮醇提物5.18mg(按醇提物得率換算，相當于14mg生藥材)，40μL DMSO震蕩溶解，加入DMEM培養(yǎng)基0.96mL，混合均勻，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得濃度為5 180μg/mL的陳皮醇提物溶液。依次對半稀釋，得濃度為2 590μg/mL、1 295μg/mL、647.5μg/mL的陳皮醇提物溶液，備用。

2.2.3 陳皮水提物溶液配制 用十萬分之一電子天平精密稱取陳皮水提物2.81mg(按水提物得率換算，相當于7mg生藥材)，20μL DMSO震蕩溶解，加入DMEM培養(yǎng)基0.98mL，混合均勻，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得濃度為2 810μg/mL的陳皮水提物溶液，備用。

2.2.4 橙皮苷部位溶液的配制 用十萬分之一電子天平精密稱取橙皮苷部位0.50mg(按橙皮苷部位得率換算，相當于7mg生藥材)，20μL DMSO震蕩溶解，加入DMEM培養(yǎng)基0.98mL，混合均勻，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得濃度為500μg/mL橙皮苷部位溶液，備用。

2.3 細胞給藥濃度確定

2.3.1 細胞培養(yǎng)與分組 RAW264.7細胞在含有10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1鏈霉素的DEME高糖培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、飽和濕度空氣的培養(yǎng)箱37℃孵育，每2～3天傳代1次。

實驗時，將RAW264.7細胞按60 000個/mL密度接種于96孔板中，隨機分為6組，每組設(shè)6個復孔：①空白對照組：每孔加入200μL DMEM高糖培養(yǎng)基；②LPS模型組：每孔加入180μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液；③518μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的 LPS溶液、20μL 5180μg/mL的陳皮醇提物溶液；④259μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2590μg/mL的陳皮醇提物溶液；⑤129.5μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 1 295μg/mL的陳皮醇提物溶液；⑥64.75μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 647.5μg/mL的陳皮醇提物溶液。

2.3.2 NO釋放量測定 NO分泌量用NO試劑盒進行測定。NO在生理溶液中不穩(wěn)定，大部分NO快速代謝成亞硝酸鹽NO2-和NO3-。本試劑盒采用硝酸還原酶特異性地將NO3-還原為NO2-，NO2-與顯色劑作用生成有色物質(zhì)，用比色法測定NO2-濃度即代表NO水平。

將加藥后的96孔板在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用移液槍從每孔吸取100μL上清液，按NO試劑盒方法，酶標儀570nm測定培養(yǎng)板中各孔吸光度值。

2.3.3 細胞活力測定 細胞活力用MTT法進行測定。將細胞以60 000個/mL密度接種于96孔板中，按照“2.3.1”項下的方法分組培養(yǎng)24h后，移除培養(yǎng)液，每孔加入180μL新鮮的培養(yǎng)基和20μL MTT 溶液(5g·L-1)，孵育4h后吸出上清，每孔加入200μL DMSO，輕輕振蕩10min，待藍紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在492nm波長處測定各孔吸光度值。

2.4 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位抗炎活性比較

RAW264.7細胞在含有10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1鏈霉素的DEME高糖培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、飽和濕度空氣的培養(yǎng)箱37℃孵育，每2～3天傳代1次。

實驗時，將RAW264.7細胞按60 000個/mL密度接種于96孔板中，隨機分為6組，每組設(shè)6個復孔。①空白對照組：每孔加入200μL DMEM高糖培養(yǎng)基；②LPS模型組：每孔加入180μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液；③陳皮水提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2810μg/mL的陳皮水提物溶液；④陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2 590μg/mL的陳皮醇提物溶液；⑤橙皮苷部位組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 500μg/mL的橙皮苷部位溶液。

將加藥后的96孔板在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，參照“2.3.2”項、“2.3.3”項下方法，測定模型細胞NO的釋放量及細胞活力。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 細胞給藥濃度確定

NO分泌量用NO試劑盒進行測定。結(jié)果顯示，造模組NO值明顯升高，且與空白組作t檢驗的P值<0.01，說明造模成功。518μg/mL、259μg/mL陳皮醇提物組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗的P值<0.01，說明518μg/mL、259μg/mL的陳皮醇提物具有極顯著抗炎活性。129.5μg/mL陳皮醇提物給藥組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗的P值<0.05，說明129.5μg/mL的陳皮醇提物具有顯著抗炎活性。64.75μg/mL的陳皮醇提物組NO值略有降低，與造模組作t檢驗的P值>0.05，說明64.75μg/mL的陳皮醇提物無明顯的抗炎活性。具體結(jié)果見表1。

表1 不同濃度的陳皮醇提物對RAW264.7細胞NO釋放量的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

細胞活力用MTT法進行測定。結(jié)果顯示，518μg/mL陳皮醇提物組細胞存活率降低，且與空白組作t檢驗的P值<0.05，說明518μg/mL陳皮醇提物具有一定的細胞毒性。259μg/mL、129.5μg/mL、64.75μg/mL的陳皮醇提物組與空白對照組比較，P值>0.05，說明上述3個濃度的陳皮醇提物對RAW264.7細胞活力無明顯影響，具體結(jié)果見表2。

表2 不同濃度的陳皮醇提物對RAW264.7細胞活力的影響

注：與空白組比較，#P<0.05。

小結(jié)：以抗炎活性和對細胞活力的影響為指標，將抗炎活性比較研究中陳皮醇提物的細胞給藥濃度確定為259μg/mL。

3.2 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對RAW264.7細胞NO釋放量的影響

NO分泌量用NO試劑盒進行測定。結(jié)果顯示，造模組NO值明顯升高，且與空白組作t檢驗的P值<0.01，說明造模成功。各給藥組與模型組比較，陳皮水提物給藥組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗的P值<0.01，說明281μg/mL的陳皮水提物具有極顯著抗炎活性。陳皮醇提物給藥組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗的P值<0.01，說明259μg/mL的陳皮醇提物具有極顯著抗炎活性。橙皮苷部位給藥組NO值有一定的降低，且與造模組作t檢驗的P值<0.05，說明50μg/mL的橙皮苷部位具有顯著性抗炎活性，具體結(jié)果見表3。NO抑制率=(模型組OD值-測定組OD值)/模型組OD值。

表3 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對RAW264.7細胞NO釋放量的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

3.3 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對RAW264.7細胞活力的影響

細胞活力用MTT法進行測定。結(jié)果顯示，模型組、各

給藥組與空白對照組比較，P>0.05，說明各個給藥組對RAW264.7細胞活力均無明顯影響，具體結(jié)果見表4。存活率=給藥組OD值/空白組OD值×100%。

表4 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對RAW264.7細胞活力的影響

4 討論

研究表明[4]，巨噬細胞受到外界刺激極易被激活引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥介質(zhì)或致炎物可誘導或增加局部NO的合成和釋放。本研究以LPS誘導巨噬細胞RAW264.7細胞建立炎癥模型，以模型細胞NO釋放量和細胞活力為指標，比較研究陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性，方法簡單，穩(wěn)定可靠。

很多慢性疾病的發(fā)病機制都涉及炎癥。因此，抗炎治療成為預(yù)防和治療各種疾病的重要途徑[5-6]。本次研究表明，陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位均可顯著降低模型細胞NO的釋放量，具有顯著抗炎活性。且通過各給藥組組間比較可知，陳皮醇提物、陳皮水提物的抗炎活性優(yōu)于橙皮苷部位，推測為陳皮提取物中多成分協(xié)同作用的結(jié)果。

[1] 鄭小吉，詹曉如，王小平．陳皮研究進展[J]．中國現(xiàn)代中藥，2007，9(10)：30-32．

[2] 王春燕．淺談陳皮的藥理作用及臨床應(yīng)用[J]．中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2013，11(3)：120-131．

[3] 李曉紅，齊云，蔡潤蘭，等．蘆薈大黃素對LPS誘導的RAW264.7細胞NO生成及iNOS表達的影響[J]．中國藥理學通報，2010，26(4)：488-492．

[4] Li LP, Zhang JX, Li LF, et al. Effect of an inoguanidine on pulmonary apoptosis in the lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J].Chin Phamacol Bull,2007,23(1):28-32.

[5] L JUNG T,LUNDBERG S,VARSANYI M,et al.Rectal nitric oxide as biomarker in the treatment of inflammatory bowel disease responders versus nonresponders[J].World J Gastroenterol,2006,12(21):3386-3392.

[6] LALA PK,CHAKRABORTY C.Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression[J].Lancet Oncol,2001,2(3):149-156.

(責任編輯：宋勇剛)

2014-03-10

賀燕林(1989-)，女，中國藥科大學碩士研究生，研究方向為中藥新藥研發(fā)。

楊中林(1950-)，女，中國藥科大學教授，博士生導師，研究方向為中藥新藥研發(fā)。E-mail:yzl1950@126.com。

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1673-2197(2014)13-0023-03