梁海乾 李曉紅 王景景 涂悅 陳翀 張賽

·論著·

沉默調(diào)節(jié)蛋白1促進(jìn)體外神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)☆

梁海乾*李曉紅*王景景*涂悅*陳翀*張賽*

目的 探討沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirt1)對(duì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的影響。方法體外原代分離培養(yǎng)胚胎海馬神經(jīng)元，觀(guān)察Sirt1在72 h神經(jīng)元的分布表達(dá)；通過(guò)RNAi技術(shù)下調(diào)Sirt1基因，觀(guān)察其對(duì)72 h神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度的影響；通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Sirt1基因或藥物白藜蘆醇(RES)激活Sirt1蛋白，檢測(cè)其對(duì)72 h神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度的影響。結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示Sirt1位于海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)圓錐以及胞體和突起，尤其是軸突末端；與正常對(duì)照組(Sirt1正常表達(dá)組)相比，Sirt1表達(dá)下調(diào)可顯著縮短72 h海馬神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度[由(178.3±3.2)μm縮短到(110.2± 18.30)μm，P＜0.01]；與正常對(duì)照組(Sirt1正常表達(dá)組)相比，基因過(guò)表達(dá)Sirt1可顯著增加72 h海馬神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度[由(178.3±3.2)μm增長(zhǎng)到(310.6±39.5)μm，P＜0.01]。與藥物對(duì)照組(DMSO處理組)相比，藥物RES激活Sirt1蛋白亦可顯著增加72 h海馬神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度[由(292.8±11.2)μm增長(zhǎng)到(525.1±49.7)μm，P＜0.01]。結(jié)論Sirt1在神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)中起著重要的作用，可作為軸突再生一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

Sirt1 軸突生長(zhǎng) 白藜蘆醇 神經(jīng)元

沉默調(diào)節(jié)因子1(silence regulatory proteins1，Sirt1)是第三類(lèi)組蛋白去乙?；?HDACS)一個(gè)典型的家族成員，依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白去乙?；竅1]，可與許多轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)去乙?；饔谜{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，如p53、FOXO家族蛋白、Ku70、NF-κB。Sirt1去乙?；覆粌H能使組蛋白去乙酰化，還能使p53，F(xiàn)OXO3a，Ku70去乙酰化而具有抗細(xì)胞凋亡作用。因此，Sirt1在細(xì)胞分化、存活、腫瘤發(fā)生和新陳代謝方面起重要作用。有研究報(bào)道Sirt1調(diào)控神經(jīng)元的分化[2,3],并通過(guò)在海馬區(qū)的缺血預(yù)適應(yīng)參與神經(jīng)保護(hù)作用[4],在多種神經(jīng)疾病包括阿爾茲海默病(Alzheimer，s disease,AD)的小鼠模型中能抑制神經(jīng)退行性變。Sirt1參與多種腦功能的調(diào)節(jié)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。盡管如此，關(guān)于Sirt1與軸突生長(zhǎng)聯(lián)系方面的報(bào)道是有限的，鑒于此，本文對(duì)兩者之間的聯(lián)系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象SD孕大鼠購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。GFP和Sirt1單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司。單克隆抗體Tau-1購(gòu)自Millipore公司。藥物白藜蘆醇由Sigma公司提供。羅丹明(紅)和俄勒岡(綠)標(biāo)記的熒光二抗購(gòu)自Invitrogen公司。eGFP標(biāo)記的全長(zhǎng)Sirt1增強(qiáng)質(zhì)粒和表達(dá)eGFP的抑制Sirt1基因的發(fā)卡樣小干擾RNA由日本札幌醫(yī)科大學(xué)YoshiyukiHorio博士提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及轉(zhuǎn)染原代大鼠胚胎海馬神經(jīng)元根據(jù)Li XH等[5]文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。提取孕14 d SD大鼠胚胎的海馬神經(jīng)元，并用0.125%不含鈣離子與鎂離子的Hanks’平衡鹽溶液孵育10min，1000 r/min離心5min，置于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基DMEM/F12中。細(xì)胞塊剪碎分別種植在多聚賴(lài)氨酸包被的六孔板中，含5%CO2的37℃溫箱中孵育2～4 h后，換加入2%B27和1 mmol/L谷氨酰胺的神經(jīng)元維持培養(yǎng)基體外培養(yǎng)7 d，每3 d半量換液。神經(jīng)元用Lipofectamine 2000與質(zhì)?；蛐「蓴_RNA等比例混合(1:2)，倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功表達(dá)綠色熒光蛋白；神經(jīng)元用藥物DMSO和250 nmol/L的白藜蘆醇處理后，觀(guān)察神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度的變化。本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，基因調(diào)控部分3組：正常對(duì)照組(n=6)、轉(zhuǎn)染eGFP-siSirt1組(n=6)和轉(zhuǎn)染eGFP-Sirt1組(n=6)；化學(xué)藥物處理部分分兩組：藥物對(duì)照組(n=6)和250 nmol/L的白藜蘆醇處理組(n=6)。

1.3 免疫熒光染色神經(jīng)元細(xì)胞首先用0.01mol/L的PBS緩沖液沖洗，4%的多聚甲醛固定15min；0.3%細(xì)胞破膜劑TritonX-100處理15 min，PBS沖洗2次；0.5%H2O2甲醇溶液孵育10min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；室溫下5%的脫脂奶粉封閉非特異性位點(diǎn)；一抗(3%的胎牛血清稀釋)孵育4℃過(guò)夜，相應(yīng)的熒光二抗結(jié)合，熒光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.4 軸突長(zhǎng)度的定量測(cè)定神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度的測(cè)定采用美國(guó)NIH圖像分析軟件。神經(jīng)元最長(zhǎng)的神經(jīng)突起于體外培養(yǎng)3～5 d時(shí)測(cè)量。平均的突起長(zhǎng)度為圖像中總的像素點(diǎn)數(shù)減去胞體的像素?cái)?shù)除以平均每千分尺軸突的數(shù)目和圖像中總胞體數(shù)。免疫染色的熒光強(qiáng)度通過(guò)ImageJ軟件分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 15.0分析，顯著性差異采用單因素方差分析(LSD-t檢驗(yàn))和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Sirt1可位于神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)圓錐海馬神經(jīng)元在72 h時(shí)用4%多聚甲醛固定，然后采用抗Tau-1抗體行免疫熒光染色(Tau-1顯示神經(jīng)元的軸突)，Sirt1蛋白因攜帶GFP而顯示為綠色。結(jié)果顯示，Sirt1除了在神經(jīng)元的胞體和突起表達(dá)以外，也可在神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)圓錐中表達(dá)(見(jiàn)圖1)。

2.2 下調(diào)Sirt1基因抑制軸突生長(zhǎng)采用eGFP標(biāo)記的Sirt1干擾RNA(siRNA-Sirt1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元，72 h時(shí)通過(guò)綠色熒光蛋白與Tau-1(圖2，紅色)免疫染色測(cè)量軸突長(zhǎng)度與數(shù)目。與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-Sirt1質(zhì)粒的神經(jīng)元，其軸突長(zhǎng)度從(178.3±3.2)μm顯著縮短到(110.2±18.3)μm (F=157.533，P＜0.01)。

2.3 軸突形成前上調(diào)Sirt1基因或激活Sirt1蛋白促進(jìn)軸突生長(zhǎng)表達(dá)eGFP-Sirt1或正常對(duì)照組的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)72 h后固定，進(jìn)行免疫熒光來(lái)標(biāo)記軸突的標(biāo)記Tau-1來(lái)測(cè)量神經(jīng)元軸突的改變。與正常對(duì)照組神經(jīng)元相比，表達(dá)eGFP-Sirt1神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度由(178.3±3.2)μm增長(zhǎng)到(310.6± 39.5)μm(F=157.533，P＜0.01)。白藜蘆醇處理組的原代海馬神經(jīng)元與藥物對(duì)照組（DMSO處理）相比，神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度由(291.7±13.2)μm增加至(525.1±49.1)μm(t=-4.56，P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

3 討論

圖1 Sirt1富集于軸突末端的生長(zhǎng)圓錐：檢測(cè)72 h海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)Sirt1與神經(jīng)元的標(biāo)記Tau-1共定位且在整個(gè)神經(jīng)元均有表達(dá)，尤其是軸突末端的生長(zhǎng)圓錐，如圖中1和2所示（上圖標(biāo)尺:10μm，下圖1、2分別為上圖框內(nèi)放大圖，標(biāo)尺2μm）

圖2 軸突形成前，下調(diào)Sirt1基因抑制軸突伸長(zhǎng)：檢測(cè)轉(zhuǎn)染siSirt1基因表達(dá)GFP的海馬神經(jīng)元72 h軸突長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Sirt1基因可明顯阻礙軸突的生長(zhǎng)，如圖箭頭所示（標(biāo)尺:20μm）

Sirt1可能在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮作用，在高等動(dòng)物胚胎大腦中就高度表達(dá)，在華勒(氏)變性小鼠研究中被證明有神經(jīng)保護(hù)作用，在培養(yǎng)的細(xì)胞中也已直接參與對(duì)抗應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用。在P25過(guò)表達(dá)的模型中，Sirt1已被證明具有防止神經(jīng)退行性變的作用。最近發(fā)現(xiàn)Sirt1與微管相關(guān)蛋白Tau相互作用。在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中，降低Tau蛋白的乙?；饔脮?huì)增加Sirt1的降解[6]。此外，有研究顯示在Sirt1基因敲除小鼠中，Sirt1在增強(qiáng)記憶和適應(yīng)性方面發(fā)揮積極作用[7]。Sirt1介導(dǎo)的自噬作用已為我們所知[8]，例如細(xì)胞骨架蛋白Tau的脫乙酰作用與降解[9]。在AD患者腦中伴隨神經(jīng)元軸突的變性Sirt1活性隨之下降[10]。所有這些均提示Sirt1在軸突生長(zhǎng)與維持方面起關(guān)鍵作用。盡管如此，Sirt1與軸突生成之間的聯(lián)系還是很不明了。軸突生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。Sirt1介導(dǎo)的軸突生長(zhǎng)潛在的機(jī)制并不清楚。Sirt1在不同蛋白、不同的生物進(jìn)程中通過(guò)脫乙酰作用而發(fā)揮重要作用[4]。

圖3 軸突形成前，上調(diào)Sirt1基因增加神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度：檢測(cè)轉(zhuǎn)染Sirt1基因表達(dá)GFP的海馬神經(jīng)元72 h，發(fā)現(xiàn)上調(diào)Sirt1基因能明顯增加神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度并在軸突末端形成功能性結(jié)構(gòu)，如圖中1-6所示（1-6為上圖框內(nèi)的放大圖，標(biāo)尺:20μm）

圖4 軸突形成前，RES激活Sirt1蛋白可促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)：檢測(cè)Sirt1蛋白激活劑RES處理海馬神經(jīng)元72 h時(shí)的軸突長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)Tau-1與MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，如圖箭頭所示（標(biāo)尺:20μm）

Sirt1位于神經(jīng)元軸突末端，尤其是軸突生長(zhǎng)圓錐，在軸突生成中或許起重要作用。因此，我們研究了位于軸突生長(zhǎng)圓錐的Sirt1。首次在極化與未極化的神經(jīng)元軸突，包括生長(zhǎng)圓錐均發(fā)現(xiàn)Sirt1的表達(dá)。為進(jìn)一步研究Sirt1在軸突發(fā)育中所起得作用，接下來(lái)我們應(yīng)用Sirt1基因敲除的小干擾RNA驗(yàn)證了Sirt1對(duì)軸突長(zhǎng)出的重要性，進(jìn)一步證明了Sirt1在軸突發(fā)育中的重要性。而后，驗(yàn)證Sirt1基因上調(diào)有益于軸突生長(zhǎng)。結(jié)果提示Sirt1基因的上調(diào)在神經(jīng)元極化建立以前能夠刺激功能性軸突發(fā)生。在eGFP-Sirt1組我們觀(guān)察到樹(shù)突末端的區(qū)域同樣被Tau-1染色，提示有些樹(shù)突具備轉(zhuǎn)化成軸突的潛能（圖3，1～6）。我們還發(fā)現(xiàn)隨著軸突的增加樹(shù)突的數(shù)目減少，可能多軸突形成導(dǎo)致了樹(shù)突的轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用藥物RES，它是Sirt1的一種激活劑，它能避免神經(jīng)功能失常而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能大大促進(jìn)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)。

綜上所述，Sirt1在軸突生長(zhǎng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可能是作為軸突相關(guān)神經(jīng)疾病一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)為我們進(jìn)一步研究Sirt1與軸突再生的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Silence regulatory protein 1 p romotes axonal ou tgrow th in vitro.

LIANG Haiqian, LI Xiaohong, WANG Jingjing, TU Yue, CHEN Chong, ZHANG Sai.
Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology,Brain Hospital ofAffiliated Hospital ofLogisticsUniversity ofChinese People's Armed Police Forces,Tianjin 300162,China.Tel:022-60577101.

ObjectiveTo investigate the effectofsilence regulatory protein 1(Sirt1)on axonal outgrowth.MethodsThe hippocampal neuronswas first isolated in vitro from ratembryos.The distribution and expression of Sirt1 were then detected 72 h later.The down-regulation of Sirt1 was induced by RNAi technology and up-regulation of Sirt1 was induced by overexpression of Sirt1 and resveratrol(RES).Immunofluorescence staining was used to examine the axon length.ResultsImmunofluorescence staining showed that Sirt 1 was located in neuronal cell body and neurite,especially in the distal axons.Down-regulation of Sirt1 significantly decreased axonal length compared with siRNA control group [(178.3±3.2)μm vs.(110.2±18.30)μm,P＜0.01];Overexpression of Sirt1 significantly increased axonal length compared with eGFP controlgroup[(178.3±3.2)μm vs(310.6±39.5)μm,P＜0.01];Activation of Sirt1 by RES treatmentalso significantly increased axonal length compared with vehicle control group(DMSO treated group)[(291.7±13.2)μm vs. (525.1±49.1)μm,P＜0.01].ConclusionsSirt1 plays a key role in axonal growth whichmay be used asa potential therapeutic targetofaxon regeneration.

Sirt1 Axon growth Resveratrol Neuron

R741

A

2013-11-07）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.06.001

☆國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81271392，81301050，81341113），武警后勤學(xué)院資助項(xiàng)目（編號(hào)：WHB201212），中國(guó)博士后基金（編號(hào)：2013M542583）

*腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院(天津300162)