趙 瑾，田俏梅，吳白平

(湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，湖南長沙410013)

目前，針對初診的非小細(xì)胞肺癌晚期患者應(yīng)常規(guī)檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變，用于選擇是否一線或二線使用非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)。目前臨床用于EGFR檢測的標(biāo)本主要是腫瘤組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，包括手術(shù)切除標(biāo)本、活檢組織標(biāo)本、新鮮穿刺標(biāo)本以及胸腔積液、痰液等。血液學(xué)標(biāo)本目前處于臨床研究階段，暫

未在臨床進(jìn)行使用。由于胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少，其主要用于無法獲得組織標(biāo)本的情況下使用，且需要靈敏度較高的檢測方法才能提高EGFR基因突變的檢出率。本研究針對中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院存檔的非小細(xì)胞肺癌活檢標(biāo)本和胸腔積液標(biāo)本，用焦磷酸測序的方法檢測EGFR基因18～21外顯子突變檢測，探討胸腔積液作為晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因檢測標(biāo)本的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013－03～2014－02中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤醫(yī)院初診的非小細(xì)胞肺癌患者胸腔鏡活檢標(biāo)本43例，配對收集相同患者胸腔積液43例。其中男24例，女19例，中位年齡58歲。病理組織類型為腺癌36例、鱗癌7例。

1.2 樣本的采集和處理

收集患者胸腔鏡下新鮮活檢標(biāo)本和50ml胸腔積液，胸腔積液在室溫下13000r/min離心10min，棄上清，將細(xì)胞沉淀進(jìn)行細(xì)胞涂片，經(jīng)病理醫(yī)生評估后，確保為非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本，且腫瘤細(xì)胞含量＞5%后，立即常溫下送至檢驗(yàn)科。采集同一患者配對的新鮮活檢組織，采用中性福爾馬林溶液固定及石蠟包埋，經(jīng)病理醫(yī)生評估選取腫瘤細(xì)胞含量＞10%以上的石蠟組織，切取5μm厚的石蠟白片10～15片，置于無菌的EP管中，用二甲苯和無水乙醇脫蠟后沉淀、烘干。

1.3 基因組DNA提取

采用德國凱杰公司的QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒(貨號:56404)，按試劑盒說明書操作提取基因組DNA，用上海元析公司的B－500超微量分光光度計(jì)測定DNA純度及含量，要求 A280/A260＞1.80。

1.4 PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序

采用長沙三濟(jì)生物科技有限公司的EGFR基因突變檢測試劑盒，對EGFR基因18～21外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的焦磷酸測序，所有操作按試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)全程設(shè)立陰陽對照。采用德國凱杰公司的PyroMark Q24焦磷酸測序儀進(jìn)行測序。將得到的基因序列與Genbank中的EGFR基因標(biāo)準(zhǔn)序列(序列號:NG_007726)進(jìn)行比對，分析測序結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P ＞ 0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜ 0.05為差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活檢標(biāo)本EGFR基因突變率

43例胸腔鏡下非小細(xì)胞肺癌活檢標(biāo)本中檢出EGFR基因突變型12例，野生型31例，EGFR基因突變率為27.9%(12/43)。其中，EGFR基因第19外顯子突變8例，突變率為66.6%(8/12)，第21外顯子突變8例，突變率為33.3%(4/12)，見圖1。

圖1 焦磷酸測序檢測EGFR基因突變

2.2 胸腔積液標(biāo)本EGFR基因突變率

胸腔積液標(biāo)本中檢出EGFR基因突變型11例，野生型32例，EGFR基因突變率為25.6%(11/43)。胸腔積液標(biāo)本EGFR基因檢測結(jié)果有一例與配對活檢組織不符合，其他結(jié)果均一致，見圖2。胸腔積液中細(xì)胞的EGFR基因突變率略低于活檢組織標(biāo)本，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌胸腔鏡下活檢標(biāo)本EGFR基因突變率(n=43)

圖2 同一患者胸腔積液標(biāo)本與活檢組織標(biāo)本中EGFR基因檢測不符合的測序

3 討論

肺癌的死亡率在世界范圍內(nèi)的癌癥中最高，絕大部分的肺癌為非小細(xì)胞肺癌。改癌癥的藥物靶向治療是目前較先進(jìn)的技術(shù)之一。其EGFR基因是參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移，是非小細(xì)胞肺癌重要的治療靶點(diǎn)之一［1］。而治療的療效往往可通過對EGFR基因的突變檢測進(jìn)行評價，酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為靶向治療的藥物，非小細(xì)胞肺癌的EGFR基因突變與TKI有特異性反應(yīng)，也是預(yù)測KTI治療療效的指標(biāo)之一，因此對非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變的檢測就能評估治療的療效［2～4］。那么對于腫瘤基因的提取是整個評價過程的關(guān)鍵，通?？梢赃x用腫瘤組織小活檢標(biāo)本進(jìn)行，但活檢不僅有創(chuàng)也較為復(fù)雜。而目前較多的研究表明，非小細(xì)胞肺癌晚期患者往往會有胸腔積液，且在積液中能發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞［5］。因此胸腔積液也能提取EGFR基因進(jìn)行突變檢測而代替小活檢組織標(biāo)本。

本研究通過配對收集相同患者的腫瘤組織小活檢標(biāo)本與患者的胸腔積液采用PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序的方法來對比分析兩種標(biāo)本是否存在檢測結(jié)果的一致性。結(jié)果表明，胸腔鏡下非小細(xì)胞肺癌活檢標(biāo)本檢出EGFR基因突變型12例，EGFR基因突變率為27.9%(12/43)。胸腔積液標(biāo)本共檢出EGFR基因突變型11例，EGFR基因突變率為25.6%(11/43)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這與國內(nèi)外多數(shù)研究的結(jié)果基本一致［6～8］。然而國外有研究卻不支持改觀點(diǎn)［9］，本研究通過仔細(xì)核對標(biāo)本的收集、送檢、數(shù)據(jù)分析以及對比的研究的可靠性，結(jié)果還是胸腔積液標(biāo)本與腫瘤組織小活檢標(biāo)本結(jié)果無差異，支持胸腔積液標(biāo)本能代替小活檢標(biāo)本進(jìn)行檢測。

此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)胸腔積液標(biāo)本EGFR基因檢測結(jié)果有一例與配對活檢組織不符合，其他結(jié)果均一致，這可能是胸腔積液腫瘤基因突變存在異質(zhì)性有關(guān)，具體可能為靶向治療后基因的檢測的變換，更大的可能性為腫瘤的轉(zhuǎn)移與原發(fā)病灶不一樣。那么對于這種現(xiàn)象，可以在胸腔積液標(biāo)本檢測的基礎(chǔ)上取腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，理論上活檢組織的檢測結(jié)果更支持臨床需要。

通過實(shí)驗(yàn)以及參照文獻(xiàn)，基本可以認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌患者的胸腔積液標(biāo)本能夠代替腫瘤組織活檢標(biāo)本對EGFR基因突變的檢測?；诖擞^點(diǎn)，由于胸腔積液的收集更為簡便，檢測也較可靠，在臨床上可以參考應(yīng)用。

［1］Scaglotti G V，Selvaggi G，Novello S，et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10(12):4227－4232

［2］Dahabreh I J，Linardou H，Siannis F，et al.Somatic EGFR mutation and gene copy gain as predictive biomarkers for response to tyrosine kinase inhibitors in non － small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2010，16(1):291 － 303

［3］Kosaka T，Yamaki E，Mogi A，et al.Mechanisms of resistance to EGFR TKIs and development of a new generation of drugs in nonsmallcell lung cancer［J］.JBiomed Biotechnol，2011，165214

［4］Hirsh V.Managing treatment－ related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non－small－cell lung cancer［J］.Curr Oncol，2011，18(3):126 － 138

［5］謝強(qiáng)，陳群，石琴，等.內(nèi)科胸腔鏡非小細(xì)胞肺癌活檢標(biāo)本及胸腔積液中EGFR基因突變檢測［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29(8):881－883

［6］王立帥，張瑜，陸小軍，等.雙環(huán)探針特異引物熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變［J］.中華病理學(xué)雜志，2011，40(10):667 －670

［7］范苗靜，李海剛，呂志強(qiáng)，等.表皮生長因子受體基因突變與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系［J］.中華病理學(xué)雜志，2011，40(10):679 －682

［8］魏搖冰，馬搖杰，馬智勇，等.肺腺癌患者惡性胸腔積液中EGFR突變狀況分析［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28(3):323－325

［9］Wu SG，Gow CH，Yu C J，etal.Frequentepidermal growth factor receptor gene mutations pleural effusion of lung adenocarcinama［J］.Eur Respir J，2008，32(4):924 －930