汪濤 趙雁平 胡衛(wèi)東 高永喜 劉輝 曾凡波

·實驗研究·

益眠達片對失眠大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

汪濤 趙雁平 胡衛(wèi)東 高永喜 劉輝 曾凡波

目的觀察益眠達片對失眠大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，探討其治療失眠的作用機制。方法

將大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、益眠達片組，艾司唑侖組，每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠均用對氯苯丙氨酸建立大鼠失眠模型。益眠達片組和艾司唑侖組分別給予益眠達片和艾司唑侖混懸液灌胃，其余2組給予生理鹽水灌胃。6 d后，采用熒光分光光度計測定下丘腦內(nèi)去甲腎上腺素（NE）及5-羥色氨（5-HT）、5-羥吲哚醋酸（5-HTAA）含量。結(jié)果與模型對照組比較，益眠達片組可以降低大鼠下丘腦內(nèi)NE含量、升高下丘腦內(nèi)5-HT、5-HTAA含量 （P＜0.01）。結(jié)論益眠達片改善失眠大鼠唾眠的機制與其影響大鼠下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)。

益眠達片；失眠；大鼠；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

益眠達片為解放軍武漢療養(yǎng)院研制開發(fā)的純中藥制劑，具有益氣生津，安神補腦，鎮(zhèn)靜安眠作用。用于治療失眠、多夢、神經(jīng)衰弱等癥。與傳統(tǒng)治療失眠的苯二氮艸卓類藥物相比，益眠達片的鎮(zhèn)靜催眠的作用機理可能有所區(qū)別，本研究以PCPA大鼠失眠模型為研究對象，觀察益眠達片對大鼠下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（NE）及5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HTAA）含量的影響，探討其鎮(zhèn)靜催眠作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級健康W istar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，同濟醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（鄂）2010-0009。提前1周將大鼠飼養(yǎng)在12 h光照（7：00-19：00時）、12 h黑暗（19：00-7：00時）的安靜環(huán)境下，自由攝食飲水，室溫（24±2）℃，相對濕度40%～60%。60只大鼠按照隨機數(shù)字表分為4組各15只，分別為益眠達片組、空白對照組、模型對照組、艾司唑侖組。

1.2 儀器與試劑 日本島津熒光分光光度計，RC5C低溫高速離心機 （美國杜邦公司），F(xiàn)A2204B電子分析天平（上海臺衡電子衡器有限公司）。益眠達片由合歡皮、首烏藤、五味子等組成，由中國人民解放軍武漢療養(yǎng)院制劑室提供，生產(chǎn)批號131108，規(guī)格0.3 g／片，用前用蒸餾水配制成濃度為0.24 g／m L的混懸液。艾司唑侖片 （華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：20120805）。對氯苯丙氨酸（PCPA，批號C6506）、5-羥色胺標準品、5-羥吲哚乙酸標準品、去甲腎上腺素標準品均購自美國SIGMA公司；0.9%NaCl注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號130416804）；鄰苯二甲醛（OPT）購自北京舒伯偉化工儀器有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.3 失眠大鼠模型制備 除空白對照組外，其余各組大鼠參照文獻［1］并結(jié)合預實驗結(jié)果，按300 mg／kg體質(zhì)量以10 m L／kg體積腹腔注射PCPA，于每日上午8：00-8：30點進行，1次／d，連續(xù)2 d。于第1次腹腔注射28～30 h后，動物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動不停，整體觀察與正常對照組有明顯不同，表明模型復制成功［2］。

1.4 給藥方法 各組大鼠于造模第3日開始每日8：00灌胃給藥。益眠達片組大鼠每天按12.0 g／kg（為成人用量10倍）灌胃；艾司唑侖組大鼠每天按0.3mg／kg（為成人用量10倍）灌胃給予艾司唑侖；空白對照組、模型對照組予等量生理鹽水，1次／d，連續(xù)灌胃6 d。

1.5 大鼠下丘腦內(nèi)NE含量的測定 參照文獻［3］方法將大鼠脫頸椎處死，取腦，放在預先冰冷的生理鹽水中，去除腦膜血管。在冰冷平皿上分離下丘腦，稱重；放在預先冰冷的玻璃勻漿器中，加5 m L酸性正丁醇，勻漿，1 500 r／m in離心10 m in，吸上層正丁醇2 m L加入含有1.5 m L磷酸0.1 mol／L緩沖液（pH 6.5）的具塞離心管中，振搖10 m in，NE被抽提到緩沖液中。取1.5 m L上述磷酸提取液按文獻方法與氧化碘試劑進行反應，反應液在熒光計上以385 nm激發(fā)、485 nm、狹縫5處測定熒光強度。試劑空白和組織空白是將氧化劑和還原劑加入次序顛倒，其他步驟不變。根據(jù)標準曲線將各組熒光讀數(shù)轉(zhuǎn)化為濃度值，進行統(tǒng)計學處理。

1.6 大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HIAA含量測定下丘腦分離同上。參照文獻［4］方法，組織稱重后立即置于含有冷酸性正丁醇（100 mg組織／1 m L正丁醇）勻漿器中，在冰浴條件下勻漿后，離心（3 000 r／min，5 min），吸取5 m L×2上清液，分別加到兩支帶塞離心管中，分離5-HT、5-HTAA。被提取的5-HT、5-HTAA與OPT作用后，在激發(fā)光365 nm、發(fā)射光480 mim、狹縫5條件下測定樣品的熒火強度。按文獻同時制備標準管、樣品空白管。按公式計算5-HT、5-HTAA含量，并進行統(tǒng)計學處理。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以 （±s）表示，多組間比較采用方差分析，并進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)NE含量比較 益眠達片組大鼠下丘腦內(nèi)NE含量明顯低于空白對照組及模型對照組 （P＜0.05或P＜0.01），說明益眠達片可以降低大鼠下丘腦內(nèi)NE含量。見表1。

2.2 各組PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HIAA含量比較 模型對照組大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HTAA含量明顯低于空白對照組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；益眠達片組下丘腦內(nèi)5-HT、5-HTAA含量較模型對照組有顯著性升高（P＜0.01），與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)NE、5-HT、5-HIAA含量比較（±s）

表1 PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)NE、5-HT、5-HIAA含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

15 18.24±3.67 0.89±0.34 0.23±0.12模型對照組 15 19.56±2.93 0.71±0.29a0.17±0.09a益眠達片組 15 15.18±2.75ab1.05±0.31b0.24±0.11b艾司唑侖片組15 14.61±3.84ab1.10±0.42b0.25±0.23 -HIAA空白對照組組別 只數(shù) NE 5-H t 5 b

3 討論

失眠是人體最為常見的睡眠-覺醒節(jié)律紊亂［5］，NE與5-HT是公認的參與睡眠-覺醒機制的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)［6］，而5-HIAA是腦內(nèi)5-HT的主要代謝途徑。研究表明，腦內(nèi)5-HT有增加睡眠作用［7-9］，而NE在維持覺醒中起著重要作用。NE對中樞神經(jīng)元既有興奮又有抑制作用，在特定的部位有其特定的作用，常以興奮作用為主。5-HT多呈抑制效應，腦干中的5-HT有利于維持慢波睡眠，而慢波睡眠又有利于疲勞的恢復［10］。本研究采用目前較公認的失眠模型PCPA化大鼠，探索益眠達片對失眠大鼠下丘腦內(nèi)主要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，以期明確該方在腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)方面的作用機制。結(jié)果顯示，服藥6天后，益眠達片可降低大鼠下丘腦內(nèi)NE含量，恢復失眠大鼠下丘腦5-HT和5-HTAA含量。這可能是益眠達片治療失眠的內(nèi)在機制之一。

［1］肖成榮，馬增春，李海靜，等.PCPA失眠大鼠模型的制作及其機制［J］.藥理毒理學雜志，2007，21（4）：326.

［2］ 余敏，唐成林，劉祖麗，等.不同強度電針刺激對失眠大鼠下丘腦orexinA的影響研究［J］.醫(yī)學分子生物學雜志，2011，8（1）：70-74.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：3.

［4］ 方福德，周呂，丁濂，等.現(xiàn)代醫(yī)學實驗技巧全書［M］.北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1995：12.

［5］ 梁春蓮，陳芬.原發(fā)性失眠患者個性及心身健康研究［J］.實用醫(yī)學雜志，2007，23（1）：120-121.

［6］Krueger JM，Obal FJ，Kapas L，et al.Brain organization and sleepfunction［J］.Brain Res，1995，69（2）：177-185.

［7］靳照宇.5-HT1Ah和5-HT2受體功能與覺醒、睡眠成分關(guān)系的研究［J］.中國藥理學通報，2000，16（2）：208.

［8］ 朱國慶.5-羥色胺和環(huán)磷酸腺苷對睡眠的影響［J］.中國藥理學通報，1999，49（2）：135-140.

［9］王志.腹側(cè)背蓋區(qū)DA神經(jīng)元調(diào)節(jié)睡眠-覺醒機制的探討［J］.生理學報，1997，49（2）：135-139.

［10］付乙.中藥對運動性失眠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和免疫功能的影響［J］.四川中醫(yī)，2004，22（4）：14-15.

Influence of Yimianda tablets on the contents of monoamines neurotrans mitters in hypothala-mus of insomniarats

Wang Tao，Zhao Yanping，Hu Weidong，Gao Yongxi，Liu Hui，Zen Fanbo.*People’s Liberation Army Wuhan Sanatorium 430074，China

ObjectiveThe influence of Yimianda tablets on the contents of monoam ines neurotransmitters in Hypothalamus of insomnia rats，to explore themechanism of curative effect of Yim ianda tablets.Methods40W istar ratswere randomized into the blank control group，model group，Yim ianda tablets group，and Estazolam group，each group had 10 rats.The experimentalmodelof insomnia ratswas induced by PCPA.The rats of Yim ianda tablets group give Yimianda Suspension gavaged，The rats of Estazolam group give Estazolam Suspension gavaged.The rats of blank control group and model group give NS gavaged.After 6 days，used fluorescence spectrophotometer determ ined the contents of NE、5-HT、5-HTAA in the hypothalamus of insomnia rats.ResultsCompare with themodel group’s rats，the Yim ianda tablets group’s rats’the contents of NE was reduced and the contents of 5-HT、5-HTAA was increased in the hypothalamus（P＜0.01）.ConclusionThe mechanism of Yimianda tablets’improve insomnia related to influence the contents ofmonoam ines neurotransm itters in hypothalamus of insomnia rats.

Yim ianda tablet；Insomnia；Rat；Monoam ines neurotransm itters

430074廣州軍區(qū)武漢療養(yǎng)院（汪濤、胡衛(wèi)東、高永喜、趙雁平）；430072廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院（劉輝）；430030華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院 （曾凡波）