焦晶凱，莫蓓紅

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原以畜牧業(yè)為主，是傳統(tǒng)奶制品的發(fā)源地之一，發(fā)酵乳制品種類繁多，奶酪是奶制品中最普遍的食品，為蒙古族人所喜愛，奶酪多以手工家庭制作為主，不添加任何商業(yè)菌株，以自然發(fā)酵為主，發(fā)酵菌株來自原料乳以及周圍的環(huán)境，這些菌株賦予了奶制品特殊的風(fēng)味和質(zhì)地。已有研究顯示，傳統(tǒng)手工干酪中菌種豐富，包含乳桿菌（Lactobacillussp.）、明串珠菌（Leuconostocssp.）、腸球菌（Enterococcisp.）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等[1-4]。然而此前研究微生物多樣性通常使用Sanger第一代測(cè)序技術(shù)，主要以DNA單鏈為模板，加入脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）和熒光雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳分離和激光誘導(dǎo)熒光顏色區(qū)分，獲得堿基組成序列，但其成本高、測(cè)序通量低、信息不精確[5]。

第二代測(cè)序Illumina MiSeq方法分析有效的避免了通量低、操作復(fù)雜和準(zhǔn)確率低等缺陷[6-9]，相對(duì)于Roche 454焦磷酸測(cè)序，具有操作簡(jiǎn)單、成本較低的優(yōu)勢(shì)，并且采用邊合成邊測(cè)序原理，結(jié)果可信度高，MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)集中了Roche 454[10-11]和Illumina HiSeq 2500的優(yōu)點(diǎn)，不僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)多樣品的多個(gè)可變區(qū)同時(shí)測(cè)序，而且在測(cè)序速度和測(cè)序通量上都有進(jìn)一步提升，目前此平臺(tái)已在微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)研究方面受到了廣大學(xué)者的認(rèn)可[12-13]。全基因組測(cè)序?qū)θ媪私庖粋€(gè)樣本的微生物組成、分子進(jìn)化等有著非常重要的意義。SCHMIDT P A等[14]使用Illumina高通量測(cè)序測(cè)定了土壤中真菌微生物多樣性，并得到了較為理想的結(jié)果。趙爽[15]使用Illumnina高通量技術(shù)成功分析了對(duì)噴施氯苯嘧啶醇后的草坪根際土壤中真菌群落的多樣性。

本研究使用Illumina MiSeq第二代測(cè)序方法測(cè)定來自內(nèi)蒙古呼倫貝爾的4個(gè)地區(qū)的不同干酪樣品，對(duì)其中微生物組成進(jìn)行詳盡的分析，同時(shí)分析了不同樣品間物種差異和進(jìn)化關(guān)系等。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

干酪樣品來自于內(nèi)蒙古呼倫貝爾的4個(gè)地區(qū)，分別是哈吉（編號(hào)C）、陳巴爾虎旗（編號(hào)D）、東烏珠爾（編號(hào)E）和西烏珠爾（編號(hào)F），這些樣品均為牧民手工制作、自然成熟干酪，保存在4℃環(huán)境下，移至-70℃長(zhǎng)期保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico Green：美國(guó)Life Technologies公司；DP328糞便基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；AP-GX-500 DNA膠回收試劑盒：美國(guó)Axygen公司；P7589 PicoGreendsDNA 定量試劑盒：美國(guó)Invitrogen公司；MiSeq測(cè)序試劑盒v2、Illumina MiSeq測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；DYY-6C電泳儀：北京天誠(chéng)沃德生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)伯樂公司；Pico17離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Aligent 2100電泳生物分析儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；BioTek酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

干酪樣品中的微生物總DNA是用糞便基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)說明書提取DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增16S rDNA的V4區(qū)域，引物520F：5′AYTGGGYDTAAAGNG3′，引物802R：5′TACNVGGGTATCTAATCC3′。PCR條件預(yù)變性是94℃5min，然后執(zhí)行94℃30s、50℃30s、72℃30s共27個(gè)循環(huán)，退火溫度72℃，時(shí)間是5min，最后保持在4℃條件下。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，切割回收，使用DNA膠回收試劑盒回收。

1.3.3 各樣本定量

采用BioTek酶標(biāo)儀對(duì)各個(gè)樣品定量，取1μL樣品加入24μL TE和25μL PicoGreen（稀釋200倍）置于costar 96孔半量酶標(biāo)儀上，在激發(fā)光485/20nm，發(fā)射光528/20nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3.4 DNA序列修飾

通過3′-5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修復(fù)帶有突出末端的DNA片段。在修復(fù)平整的DNA片段3′端引入單堿基“A”，接頭3′末端含有單堿基“T”，從而保證DNA片段和接頭能夠通過“A”“T”互補(bǔ)配對(duì)連接，并防止接頭連接DNA片段的過程中，DNA插入片段彼此相連，在連接酶的作用下，孵育含有標(biāo)簽的接頭與DNA片段，使其相連。利用PCR選擇性的富集兩端連有接頭的DNA片段，同時(shí)擴(kuò)增DNA文庫(kù)。PCR應(yīng)盡量使用較少的環(huán)數(shù)，避免PCR擴(kuò)增中文庫(kù)出現(xiàn)錯(cuò)誤。

1.3.5 驗(yàn)證和混合文庫(kù)

利用PicoGreen和熒光分光光度計(jì)方法定量文庫(kù)，使用Agilent 2100對(duì)PCR富集片段進(jìn)行質(zhì)量控制，驗(yàn)證DNA文庫(kù)的片段大小分布。

1.3.6 上機(jī)測(cè)序

將混合好的文庫(kù)（10nmol/L）逐步稀釋定量至4～5pmol/L后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，使用合成測(cè)序法，測(cè)定長(zhǎng)度2×250bp。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

1.3.7.1 原始數(shù)據(jù)處理與樣品序列數(shù)目統(tǒng)計(jì)

采用雙峰（pair-end）測(cè)序，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列（50個(gè)連續(xù)堿基平均質(zhì)量＞Q30，不允許有N）。用軟件Flash連接通過質(zhì)量控制的序列對(duì)應(yīng)的兩端序列進(jìn)行。設(shè)計(jì)無法連接的序列。對(duì)連接上的序列進(jìn)行過濾（連續(xù)相同堿基＜6；模糊堿基N＜1），獲得最終用于分析的序列。

1.3.7.2 OTU列表生成

應(yīng)用Qiime，根據(jù)序列的相似度，將序列歸為多個(gè)操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。Qiime調(diào)用uclust對(duì)序列進(jìn)行聚類，選取每個(gè)類最長(zhǎng)的序列為代表序列。采用RDP-classifier，以RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的序列為訓(xùn)練集，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行注釋。得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。

1.3.7.3 稀釋曲線及豐度分布

根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，作出每個(gè)樣品的稀釋曲線，以該曲線表明樣品的取樣深度。對(duì)各樣品的OTU豐度大小排序，對(duì)豐度值取log2的對(duì)數(shù)作豐度分布曲線圖，可提現(xiàn)樣品中物種分布的均勻性。

1.3.7.4 群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)OTU列表中獲得的分類信息與豐度進(jìn)行整理，在屬層次下對(duì)各樣品進(jìn)行物種豐度統(tǒng)計(jì)、聚類分析及PCoA分析，可得到樣品中群落組成結(jié)構(gòu)及它們的相似性。

2 結(jié)果與分析

C、D、E、F4種樣品分別讀取了26 776、25 003、17 342、24 709條有效序列和26 704、24 927、17 287、24 640條優(yōu)質(zhì)序列。

2.1 樣品所含操作分類單元及所含序列的數(shù)目

圖1 操作分類單元維恩圖Fig.1 Venn diagram of operational taxonomic unit

如圖1所示，C樣品中含有細(xì)菌種類541個(gè)，D樣品中460個(gè)，E樣品中含有563個(gè)，F(xiàn)樣品中含有593個(gè)。C和F有相同種類230個(gè)，C和D有相同種類216個(gè)，C和E有相同種類218個(gè)，F(xiàn)和D有相同種類222個(gè)，F(xiàn)和E有相同種類236個(gè)，D和E有相同種類214個(gè)。C、F和D有相同種類156個(gè)，C、F和E有相同種類153個(gè)，C、D和E有相同種類151個(gè)，F(xiàn)、D和E有相同種類167個(gè)，在相似度0.97基礎(chǔ)上分類出1 322個(gè)OTU，門1 142，綱1 057，目952，科716，屬432。

2.2 物種豐度及群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 稀釋曲線

圖2表明每個(gè)樣品的取樣深度，從4種樣品中隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)如圖2橫軸所示，縱軸則表示基于該測(cè)序條數(shù)能構(gòu)建的OUT數(shù)量，當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很??；反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。該分析是基于OTU序列差異水平在0.03即相似度97%的水平上進(jìn)行運(yùn)算的。

圖2 4種樣品的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of four cheese samples

2.2.2 豐度分布曲線

對(duì)豐度值取log2的對(duì)數(shù)值得到圖3所示的豐度分布曲線圖。橫軸所示為OTU相對(duì)豐度含量等級(jí)降序排列，縱軸對(duì)應(yīng)的是OTU（物種）所占相對(duì)豐度比例，由圖3可以看出4種樣品的曲線斜率較大。

圖3 4種樣品的風(fēng)度分布曲線Fig.3 Rank-abundance curve of four cheese samples

2.2.3 干酪中群落組成分析

在屬的層次下對(duì)各樣品物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如圖4所示，4個(gè)樣品所含物種基本相似，但物種分布差異較大，對(duì)所含主要種屬進(jìn)行了分析和歸類。由圖4可知，主要物種包括3類，乳酸桿菌（Lactobacillus）、醋酸菌（Acetobacter）和乳酸球菌（Lactococcus）；C樣品與其他3個(gè)樣品的不同在于其含量最多物種為醋酸菌醋酸菌（Acetobacter）而其他3個(gè)樣品為乳酸桿菌（Lactobacillus）；F和D樣品較為類似；E樣品相對(duì)于其他樣品來說，含有較少的醋酸菌，其他物種含量相對(duì)豐富些；此外在4種樣品中還發(fā)現(xiàn)有巨型球菌（Macrococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、鏈球菌（Streptococcus）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）和假單胞菌（Pseudomonas）等。

圖4 4種干酪樣品物種分布圖Fig.4 Species distribution in four cheese samples

2.2.4 聚類分析

本實(shí)驗(yàn)在屬的水平上利用Heapmap圖分析了4個(gè)樣品菌群的相似性和多樣性，如圖5所示，所含菌落分為3個(gè)大的分支，其中最為優(yōu)勢(shì)的OTU單元為硬壁菌門（Firmicutes）；OTU925包含序列數(shù)最多，其34 227條序列均屬于乳酸桿菌（Lactobacillus）。由圖5可知，在OTU861和9254包含序列也較多，分別屬于醋酸桿菌（Acetobacter）和乳酸球菌（Lactococcus），OTU58、OTU717、OTU73、OTU479和OTU 1178等也屬于乳酸桿菌（Lactobacillus），此外序列較多的還包含假單胞菌（Pseudomonas）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、鏈球菌（Streptococcus）和明串珠菌（Leuconostoc）等。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis base on 16S rDNA gene of four cheese samples

2.2.5 主坐標(biāo)PCoA分析

如圖6所示，利用各樣品序列間的進(jìn)化信息計(jì)算樣品距離，觀察4種不同干酪樣品多樣性差異。由圖6可知，PCoA分析中這些站點(diǎn)沒有聚在一起，距離相對(duì)較遠(yuǎn)，表明4個(gè)干酪樣品群落存在一定的差異性，因此，地域?qū)Ω鱾€(gè)群落組成有重要影響。

圖6 4種干酪樣品群落主坐標(biāo)分析Fig.6 Principal coordinates analysis of microbiota in four cheese samples

3 結(jié)論

采用Illumina MiSeq測(cè)序方法，直接從環(huán)境樣品中擴(kuò)增高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，避免了不可培養(yǎng)菌株的不可測(cè)性，客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及豐度比例，嚴(yán)格控制PCR循環(huán)數(shù)，充分發(fā)揮高通量測(cè)序的大數(shù)據(jù)量?jī)?yōu)勢(shì)。

結(jié)果表明，4個(gè)干酪樣品共分離了細(xì)菌門1 142個(gè)，綱1 057個(gè)，目952個(gè)，科716個(gè)，屬432個(gè)，主要包括乳酸桿菌（Lactobacillus）、醋酸桿菌（Acetobacter）和乳酸球菌（Lactococcus），本實(shí)驗(yàn)的稀釋曲線分析了4種樣品取樣深度，每個(gè)樣品都呈現(xiàn)相同或相似的變化趨勢(shì)，在測(cè)序量較少時(shí)，每個(gè)樣品OTU數(shù)目呈顯著上升的趨勢(shì)，而隨著測(cè)序數(shù)量的增加，每個(gè)樣品的OTU數(shù)目增加趨勢(shì)逐漸變緩，最后基本達(dá)到飽和。由本實(shí)驗(yàn)4種樣品的豐度曲線可以看出，相對(duì)于環(huán)境、土壤等樣品來說曲線較窄，說明干酪中的菌種相對(duì)來說較為單一，曲線斜率較大，由此推算4種干酪樣品中存在優(yōu)勢(shì)菌株。通過菌落組成分析，F(xiàn)、D、E 3個(gè)樣品的主要優(yōu)勢(shì)菌為乳酸桿菌，所占比例均超過了50%，而C樣品中醋酸菌所占比例超過50%，另外一種優(yōu)勢(shì)菌是乳酸球菌。PCoA分析可以看出4個(gè)樣品菌群分布大不相同，說明地域?qū)ζ湮⑸锝M成影響較大。

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