付長霞++++++張春香++++++劉立昌++++++呂世軍

[摘要] 目的 探討連接蛋白43（Connexin43， Cx43）mRNA在妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus， GDM）胎盤組織中的表達(dá)。 方法 收取GDM未治療組18例，GDM治療組22例，正常妊娠組12例， HE染色觀察各組胎盤組織標(biāo)本細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞等的變化。應(yīng)用RT-PCR方法檢測Cx43 mRNA在三組胎盤組織中的表達(dá)。結(jié)果 組織學(xué)觀察顯示GDM未治療組的胎盤組織中細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞明顯多于GDM治療組及正常對照組。三組胎盤組織中均有Cx43 mRNA的表達(dá)，Cx43 mRNA在GDM未治療組較正常妊娠組和GDM治療組降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 Cx43 mRNA在GDM胎盤中的低表達(dá)是引起胎盤結(jié)構(gòu)和功能變化的重要因素，在GDM的發(fā)病過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 妊娠期糖尿病；胎盤；連接蛋白43；RT-PCR

[中圖分類號] R714.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）10-0050-04

妊娠期糖尿?。╣estational diaetes mellitus，GDM）是指妊娠期首次發(fā)生和發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常，包括妊娠前已經(jīng)存在但被漏診的孕前糖尿病者以及孕期伴隨發(fā)生的糖耐量異常者[1]，我國GDM發(fā)病率為1%～5%[2]?？p隙連接（gap junction， GJ）是由相鄰細(xì)胞間兩側(cè)質(zhì)膜的連接子（Connexon）相連接形成的通道，每個連接子是由六個形狀相同、功能一致的蛋白分子亞基，即連接蛋白（Connexin，Cx）圍繞中央孔道排列形成的親水通道，是目前已知的細(xì)胞間直接進(jìn)行物質(zhì)交流的惟一的膜通道結(jié)構(gòu)。GJ和細(xì)胞縫隙連接通訊（gap junction intercellular communication，GJIC）可以調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞的生長抑制和轉(zhuǎn)化。連接蛋白43（Cx43）作為主要的連接蛋白，是目前人體分布最廣的一個連接蛋白[3]。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于Cx43在GDM胎盤中表達(dá)情況的研究報道。本文的研究目的是觀察Cx43 mRNA在GDM胎盤中的表達(dá)，探討Cx43 mRNA在GDM胎盤中的調(diào)控作用，為闡明Cx43在GDM發(fā)病中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年7月～2012年6月于濰坊市中醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的婦女，均排除孕前有糖尿病病史。參考2010年美國糖尿病學(xué)會（American Diabetes Association，ADA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]將患者分為三組，GDM未治療組18例； GDM治療組22例；同期分娩的正常妊娠婦女共12例作為對照組，三組孕婦年齡、分娩孕周比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。三組孕婦均無煙酒嗜好，既往無高血壓、血液病、腎臟疾病、代謝性疾病等病史。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集 三組孕婦均于胎盤娩出后胎盤稱重，直視下選取胎盤母面中央帶與中間帶組織（避開鈣化、機(jī)化灶），將其分為兩部分：一部分切成約2.0 cm ×2.0 cm ×0.5 cm小塊組織，用4%福爾馬林固定，做石蠟切片；另一部分切成約0.5 cm3的小塊，置于DEPC處理過的凍存管中，標(biāo)記后放入-70℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織蠟塊的制作及HE染色 固定，洗滌，脫水，透明，浸蠟，包埋，石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，水洗，蘇木素染色，伊紅染色，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.2.3胎盤組織Cx43 mRNA 表達(dá)水平的檢測 ①總RNA 的分離 采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，提取胎盤組織總RNA。②逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） ：采用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計Cx43 RT-PCR引物：上游：5'-ATGAGCAGTCTGCCTTTCGT-3'；下游：5'-TCTGCTTCAAGTGCATGTCC-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為249 bp。RT-PCR 在50 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行，按37℃ 60 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，94℃ 4 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR 預(yù)變性， 94℃15 s、58 ℃30 s和72℃90 s完成40個循環(huán)的PCR。③PCR瓊脂糖凝膠電泳并分析：PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入1%的瓊脂糖凝膠樣品孔中在100V恒壓下進(jìn)行15 min電泳；電泳結(jié)束后取出凝膠，于BiospectrumAC 凝膠成像分析系統(tǒng)下照相并掃描分析測定熒光密度讀數(shù)值。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 HE染色結(jié)果判定 三組標(biāo)本中，每張切片在高倍（400×）視野下隨機(jī)選取不重復(fù)的100個終末絨毛，共觀察終末絨毛5200個，觀察細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.2 胎盤組織Cx43基因的RT-PCR 結(jié)果判定 應(yīng)用RT-PCR法從正常妊娠成熟胎盤和GDM胎盤組織中成功提取總RNA，然后以總RNA為模板成功擴(kuò)增出Cx43目的基因，產(chǎn)物長度約為249 bp，結(jié)果顯示在三組胎盤組織中均有Cx43 mRNA的表達(dá)，內(nèi)參照β-actin的目的基因產(chǎn)物長度約為116 bp，電泳結(jié)果通過BiospectrumAC凝膠圖像掃描儀對DNA電泳條帶作光密度分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SAS8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計數(shù)資料采用基于二項(xiàng)分布的兩樣本率檢驗(yàn)，計量資料采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

三組標(biāo)本中觀察終末絨毛中合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陽性率及比較結(jié)果見表1。GDM未治療組與GDM治療組、GDM未治療組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均<0.05）。GDM治療組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。endprint

正常妊娠組：絨毛大小均勻，分布及形態(tài)規(guī)則，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞單層分布，合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞少見，見圖1。GDM治療組：光鏡下見成熟絨毛居多，合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞少見，見圖2。GDM未治療組：鏡下見末梢絨毛有的成熟，也有不成熟的區(qū)域。絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞單層分布，合體滋養(yǎng)細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增多，見圖3。

表1 三組胎盤組織各指標(biāo)陽性率間比較（二項(xiàng)分布正態(tài)近似法）

2.2 胎盤組織Cx43基因的RT-PCR

通過BiospectrumAC凝膠圖像掃描儀對DNA電泳條帶作光密度分析（電泳結(jié)果見圖4），用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組總體方差齊，經(jīng)單因素方差分析，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。然后用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，GDM未治療組分別與正常妊娠組和GDM治療組相比，其Cx43 mRNA均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果說明與正常妊娠組和GDM治療組相比，GDM胎盤未治療組Cx43 mRNA的表達(dá)量明顯減少。

3 討論

GDM發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，國內(nèi)外許多學(xué)者從不同方面對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，但到目前為止仍無明確的結(jié)論。胎盤是介于母體-胎兒之間的一個重要的臨時性器官，具有物質(zhì)交換、代謝、分泌激素、防御以及合成等功能，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對維持妊娠有重要作用。本文組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)GDM未治療組胎盤比GDM治療組和正常妊娠組胎盤的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增多、胎盤內(nèi)未成熟絨毛或水腫絨毛間質(zhì)內(nèi)haufbauer細(xì)胞增多等，表現(xiàn)胎盤絨毛發(fā)育不成熟與先前報道一致[5，6]。

胚胎發(fā)育早期，細(xì)胞縫隙連接蛋白就開始表達(dá)，且這種表達(dá)受時空調(diào)節(jié)，一種縫隙連接蛋白表達(dá)的同時，另一種連接蛋白的表達(dá)可能正在關(guān)閉，這種現(xiàn)象在胚胎發(fā)育中很常見。出生后每種組織表達(dá)的縫隙連接蛋白的種類和數(shù)量基本穩(wěn)定不變?？p隙連接的主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞間的電偶聯(lián)，傳遞動作電位，維持機(jī)體的電活動和機(jī)械收縮，保證活動的同步性；交換細(xì)胞間離子、營養(yǎng)物質(zhì)、液體、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；調(diào)控細(xì)胞的生長和分化；在胚胎的形成、生長和發(fā)育中調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號的傳遞；環(huán)核苷酸、鈣離子、磷酸肌醇等第二信使可以從已被激素激活的細(xì)胞通過縫隙連接進(jìn)入并激活靜止細(xì)胞，從而提高組織對激素的應(yīng)答。

本文研究發(fā)現(xiàn)，Cx43 mRNA在GDM胎盤中的表達(dá)較正常妊娠胎盤明顯減少。這可能是因?yàn)镃x43在轉(zhuǎn)錄前就存在缺陷。本文推測引起Cx43 mRNA低表達(dá)的原因可能是：①細(xì)胞中Cx43基因啟動區(qū)的CpG島甲基化。連接蛋白表達(dá)異常的主要原因是表遺傳改變，連接蛋白基因啟動區(qū)的CpG島甲基化是連接蛋白表達(dá)下調(diào)的主要原因。因在Cx43表達(dá)豐富的正常組織中Cx43基因不存在甲基化，基因過度甲基化尤其位于啟動子區(qū)域，是組織特異性基因表達(dá)缺失的一種共同機(jī)制，Cx43基因甲基化使Cx43基因異常表達(dá)，可使其在腫瘤細(xì)胞中失活，而表達(dá)減少甚至缺失。用去甲基化藥物5-氮雜胞嘧啶出來Cx43陰性的宮頸癌Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Cx43重新表達(dá)[7]。但甲基化抑制連接蛋白基因轉(zhuǎn)錄并不是唯一的原因，其他原因還未明確。②連接蛋白的基因突變：連接蛋白的表達(dá)可以抑制或誘導(dǎo)一些與生長有關(guān)的因子表達(dá)，如FGFR3、Her-2、IGF-1、P21、P27、IGFBP-4等。另外連接蛋白表達(dá)對一些分化相關(guān)因子的表達(dá)有影響。連接蛋白之所以會調(diào)控這些因子的表達(dá)，可能與這些因子的基因上存在連接蛋白反應(yīng)元件（connexin reponse element，CxRE）有關(guān)[8]。連接蛋白本身異常影響了細(xì)胞的正常增殖分化。

胎盤組織中的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞具有類似于腫瘤細(xì)胞的增殖特性。Cronier 等[9]用反義核苷酸技術(shù)證明了 Cx43在人滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞通信、滋養(yǎng)細(xì)胞融合和分化過程中起著重要作用。Dunk等[10]用實(shí)驗(yàn)證明Cx43縫隙連接斑塊在融合細(xì)胞滋養(yǎng)層表達(dá)，Cx43介導(dǎo)的GJIC在滋養(yǎng)層細(xì)胞融合過程中發(fā)揮重要的功能作用。Malassiné等[11]從人胎盤分離出滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，鑒別出不同的膜蛋白直接參與滋養(yǎng)層細(xì)胞融合：Cx43、ZO-1和Syncytins。本文研究發(fā)現(xiàn)Cx43 mRNA在GDM胎盤中低表達(dá)，可能直接導(dǎo)致細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞GJIC的結(jié)構(gòu)和功能異常，細(xì)胞失去廣泛的信號通訊，逃避正常的生長控制，最終導(dǎo)致細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞的增多。胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)眾多胎盤功能的場所，包括物質(zhì)交換、新陳代謝和合成類固醇和肽類激素，這些激素是胎兒生長發(fā)育所必需的。妊娠時胎盤可產(chǎn)生雌激素、孕酮、催乳素和胎盤生長激素等多種對抗胰島素的激素，還能分泌胰島素酶，加速胰島素的分解。所以Cx43 mRNA在GDM胎盤中低表達(dá)，將會導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)和功能異常，對抗胰島素激素分泌增多，并且加速胰島素分解，這也是導(dǎo)致GDM的發(fā)病機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)顯示GDM治療組和正常妊娠胎盤中Cx43 mRNA表達(dá)無差異，從而得出GDM患者經(jīng)過早期飲食控制、體育鍛煉或是胰島素治療等，可以改善Cx43在其胎盤中的表達(dá)，說明提高早期診治對GDM發(fā)展的重要性。

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