李春霞

(安徽理工大學醫(yī)學院，安徽 淮南 232001)

蛭弧菌(Bdellovibrio)是一類寄生于其它細菌并導致其裂解的寄生性細菌［1］。蛭弧菌具有類似噬菌體的功能，對自然環(huán)境中的細菌具有很強的裂解作用，其與宿主間并沒有嚴格的特異性，有研究表明，蛭弧菌能裂解大多數(shù)科屬的革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌［2］，能對導致人類食物中毒和漁業(yè)養(yǎng)殖病害的致病菌具有良好的裂解清除效果，且對動植物無毒副作用［3］。

響應面方法(Response Surface Methodology)是解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，其首先進行合理的試驗設計，通過實驗得到相應數(shù)據(jù)，運用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值的函數(shù)關系，通過對回歸方程的顯著分析來尋求最優(yōu)的條件參數(shù)［4］。應用Design-Expert 軟件系統(tǒng)對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，擬合曲線，建立數(shù)學模型，檢驗模型的合適性，利用三維立體圖形，觀察響應曲面，尋求最佳組合條件［5］。

本文在研究影響蛭弧菌BD1 生長的pH、鹽度(NaCl)、二價金屬離子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸鈉4個單因素實驗的基礎上，運用響應面分析法，以pH值、鹽度、二價金屬離子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸鈉為響應因素，以菌體濃度的對數(shù)值為響應值，用Design-Expert 6.0 的中心組合實驗設計(Central Composite Design，CCD)建立響應曲面模型，優(yōu)化蛭弧菌BD1 的生長條件。

1 材料和方法

菌種:蛭弧菌BD1、宿主菌由本實驗室分離保存

培養(yǎng)基:DNB 雙層平板培養(yǎng)基等均按照參考文獻［6］配制。

1.1 宿主菌培養(yǎng)

宿主菌接種于滅菌的2216E 液體培養(yǎng)基中，置于轉速為200(r·min-1)，溫度為28 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)14～15 h，使其處于對數(shù)生長期。

1.2 蛭弧菌的培養(yǎng)

將懸浮好的蛭弧菌與宿主菌以體積比2∶5 均勻混合并靜置30 min，取0.7 mL 混合液與3.5 mL 50 ℃的DNB 上層培養(yǎng)基均勻混合并傾注于DNB下層平板中。將DNB 雙層平板倒置于溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.3 實驗設計

中心組合實驗設計(Central Composite Design，CCD)是最常用的響應面分析法，適用于2～5 個因素的優(yōu)化實驗。采用該法能夠在有限的試驗次數(shù)下，對因子及其交互作用進行評價，而且還能對各因子進行優(yōu)化，以獲得影響過程的最佳條件。根據(jù)中心組合實驗設計原理，本實驗選取對蛭弧菌的生長繁殖能力具有明顯影響的4 個因素，包括二價離子(Mg2+、Ca2+)(x1)、鹽度(x2)、谷氨酸鈉(x3)和pH(x4)，每個因素選取5 個水平，分別以-2，-1，0，1 和2 進行編碼(見表1)，根據(jù)中心組合實驗設計(見表2)進行相應的實驗，研究蛭弧菌的最佳培養(yǎng)條件，為蛭弧菌的發(fā)酵培養(yǎng)提供理論基礎。

表1 中心組合實驗中的變量及其水平

表2 中心組合實驗設計及其結果

1.4 培養(yǎng)方法

取30 個150 mL 的三角瓶，每瓶中精確地分裝50 mL 新配置的DNB 液體培養(yǎng)基，根據(jù)中心組合實驗設計(見表2)調節(jié)液體培養(yǎng)基的pH、鹽度、谷氨酸鈉和Ca2+、Mg2+濃度，高壓滅菌后待用。向每瓶培養(yǎng)基中添加蛭弧菌和宿主菌，使其濃度分別達到2 ×102PFU/mL 和2 ×1010CFU/mL。在恒溫搖床中(250 r·min-1)培養(yǎng)24 h，采用DNB 雙層平板法檢測瓶中蛭弧菌的濃度。中心組合實驗需進行三次平行實驗以減少實驗誤差，實驗結果取平行實驗的平均值。

1.5 驗證實驗

以響應面分析法得到的BD1 的最佳生長條件，做3 次平行實驗，驗證試驗結果。通過實驗結果與預測結果的相符性驗證響應面分析方法的可靠性。

2 結果與分析

中心組合實驗結果如表2所示，經(jīng)Design Expert 6.0 軟件用標準多項式回歸法對實驗數(shù)據(jù)分析擬合后得到如下二次回歸方程

模型的方差分析結果如表3所示，在置信度水平α=0.01 時，該回歸模型極顯著，方程確定系數(shù)R2=0.9949，失擬項不顯著，說明對數(shù)據(jù)進行很好的擬合，代表性較好，進而可用該方程代替真實試驗點對結果進行分析和預測。同時，變差系數(shù)CV=4.75%相對較低，說明整個試驗具有良好的精密度和可靠性。

模型回歸方程系數(shù)的顯著性檢測結果如表4所示，pH 對蛭弧菌生長活性有極顯著的影響(P＜0.0001)，谷氨酸鈉濃度、鹽度和二價金屬離子濃度則對蛭弧菌的生長繁殖能力具有顯著的影響(P＜0.05)。二次項(和)均極顯著，且交互項(x2x3和x3x4)顯著(P＜0.05)，說明各因素對響應值的影響并不僅僅是簡單的線性關系，而是存在一定的交互作用，模型響應面如圖1～圖6所示。

表3 二次多項模型方差分析表

表4 二次多項模型中回歸系數(shù)的估計值

圖1 鹽度與Ca2+、Mg2+間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖2 谷氨酸鈉與Ca2+、Mg2+間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖3 pH 值與Ca2+、Mg2+濃度間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖4 谷氨酸鈉與鹽度間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖5 pH 與鹽度間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖6 pH 與谷氨酸鈉間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示兩個因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著［7］。從圖1～圖6 可以直觀地看出，鹽度和二價金屬離子，谷氨酸鈉和二價金屬離子，谷氨酸鈉與鹽度交互作用不顯著;pH 與鹽度，pH 與谷氨酸鈉，pH 與二價金屬離子交互作用顯著。

模型優(yōu)化結果顯示，當x1=-0.31，x2=-0.24，x3=-0.41，x4=0.38，即Ca2+、Mg2+濃度為6.38(mmol·L-1)，鹽度為2.88%，谷氨酸鈉濃度為4.18(mmol·L-1)，pH 為7.38 時，蛭弧菌的生長繁殖能力最強，此時模型預測蛭弧菌濃度對數(shù)值達到8.46。

為檢驗模型的可靠性，采用上述優(yōu)化條件培養(yǎng)蛭弧菌，考慮到實際操作的便利，將優(yōu)化條件修正為Ca2+、Mg2+濃度為6.4(mmol·L-1)，鹽度為2.9%，谷氨酸鈉濃度為4.2(mmol·L-1)，pH 為7.4，實際測得的蛭弧菌的濃度對數(shù)值為8.95，與理論預測值相對誤差為5.8%，因此通過該模型優(yōu)化得到的蛭弧菌BD1 的最佳培養(yǎng)條件準確可靠，具有一定的理論價值。

3 結論

本實驗采用響應面分析方法，根據(jù)中心組合設計原理設計了四因素五水平實驗，采用Design-Expert 軟件處理實驗數(shù)據(jù)，得到了菌體生長模型，以及模型最優(yōu)時各因素的水平。實驗結果顯示:BD1 的最佳生長條件為:Ca2+、Mg2+濃度為6.4(mmol·L-1)，鹽度為2.9%，谷氨酸鈉濃度為4.2(mmol·L-1)，pH 為7.4。在該培養(yǎng)條件下，菌體生長模型達到顯著水平，模型可以對蛭弧菌BD1在不同條件下的生長情況進行分析和預測，為蛭弧菌的培養(yǎng)和應用提供理論參考。

［1］STOLP H，PETZOLD H.Untersuchungen über einen obligat parasitischen Mikroorganismus mit lytischer Aktivit?t für Pseudomonas-Bakterien［J］.Journal of Phytopathology，1962，45(4):364-390.

［2］張昕，蔡俊鵬.噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用［J］.糧食與飼料工業(yè)，2004(6):38-39.

［3］LENZ R W，HESPELL R B.Attempts to grow bdellovibrios micurgically-injected into animal cells［J］.Archives of microbiology，1978，119(3):245-248.

［4］THOMPSON D.Response surface experimentation［J］.Journal of Food Processing and Preservation，1982，6(3):155-188.

［5］陶有俊，TAO D，趙躍民，等.采用Design-Expert 設計進行優(yōu)化Falcon 分選試驗［J］.中國礦業(yè)大學學報:自然科學版，2005(3):343-348.

［6］JURKEVITCH E，MINZ D，RAMATI B，et al.Prey range characterization，ribotyping，and diversity of soil and rhizosphere Bdellovibriospp.isolated on phytopathogenic bacteria［J］.Applied and environmental microbiology，2000，66(6):2 365-2 371.

［7］劉代新，寧喜斌，張繼倫.響應面分析法優(yōu)化副溶血性弧菌生長條件［J］.微生物學通報，2008，35(2):306-310.