于光明，王 偉，張 力，張德龍

1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；2錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121013

硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球處理去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)

于光明1，王 偉2，張 力2，張德龍1

1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；2錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121013

目的探討硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)的可行性。方法用復(fù)乳法制備硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球。取成年雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組(n=10)：硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植組(A組)、自體神經(jīng)移植組(B組)、改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)浸泡ChABC神經(jīng)移植對(duì)照組(C組)、改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植09%氯化鈉注射液對(duì)照組(D組)。取A、C、D 3組動(dòng)物人工切取右側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm，用改良化學(xué)法制備移植神經(jīng)段：A、C兩組浸泡在PBS液中，D組浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH 7.4)中。A組動(dòng)物取C組制備神經(jīng)行同種異體神經(jīng)移植，外膜無張力縫合，并在移植神經(jīng)段距近心端縫合處2 mm、4 mm、6 mm、8 mm處分別注入0.2 μl制備好的硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球。B組在右側(cè)離斷10 mm坐骨神經(jīng)倒置后行外膜縫合。C組取D組制備神經(jīng)行神經(jīng)移植。D組取A組制備神經(jīng)行神經(jīng)移植后，按照A組的位置注入等量等滲0.9%氯化鈉注射液。術(shù)后4、8、12周進(jìn)行大體標(biāo)本觀察，術(shù)后12周行電生理檢測(cè)、HE染色、鍍銀染色及電鏡組織學(xué)檢測(cè)、圖像分析對(duì)比。結(jié)果制備所得硫酸軟骨素酶ABC微球表面光滑，球體大小各異且均勻，無粘連及成簇等現(xiàn)象，Weibull方程曲線顯示硫酸軟骨素酶ABC微球體外釋藥穩(wěn)定。采用硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植能夠促進(jìn)大鼠神經(jīng)缺損處的軸突再生，提高神經(jīng)修復(fù)的速度和質(zhì)量，再生神經(jīng)直徑較粗，粘連較輕，電生理檢測(cè)和組織學(xué)觀察顯示各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于兩對(duì)照組，且較兩對(duì)照組修復(fù)效果更接近于自體神經(jīng)移植。結(jié)論硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植可以修復(fù)大鼠神經(jīng)損傷。

周圍神經(jīng)損傷；硫酸軟骨素酶ABC；化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)；大鼠

周圍神經(jīng)損傷后的軸突再生和功能恢復(fù)一直是外科棘手問題。有研究表明硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)能夠去除硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)對(duì)神經(jīng)再生的抑制作用，而針對(duì)硫酸軟骨素酶ABC在體內(nèi)易失活的特點(diǎn)將其制備成緩釋微球，可以更好地發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)采用改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)(freeze-thrawed combined optimized acellular nerve，F(xiàn)TOAN)作為神經(jīng)再生的三維支架，硫酸軟骨素酶ABC緩釋微球去除神經(jīng)再生的抑制因素，觀察神經(jīng)再生及修復(fù)情況。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(240±20) g。由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK[遼]2009-0004)。

2 主要試劑和儀器 聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(50∶50，6046，光華偉業(yè)實(shí)業(yè)有限公司)，硫酸軟骨素酶ABC、超速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，PBS緩沖液(珠海東大生物制品公司)，Tritonx-200(上海谷研生物科技有限公司)，聚乙烯醇(北京金鼎漢克科技發(fā)展有限公司)，低速離心機(jī)(日本KUBOTA公司)，分光光度計(jì)、掃描電鏡(德國(guó)BECKMAN公司)，AS 325多功能切片機(jī)、Histocetre 2包埋機(jī)(英國(guó)SHANDON公司)，光學(xué)顯微鏡(日本NIKON公司)等。

3 硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球的制備 參考張德盛等[1]方法，將聚乳酸-聚乙醇酸共聚物加入二氯甲烷(CH2Cl2)中，溶解后室溫下勻化成油相。將硫酸軟骨素酶ABC溶于雙蒸水后成水相，將后者加入上述油相中超聲勻化形成初乳。取聚乙烯醇和NaCl，加入雙蒸水，50℃水浴溶解，冷卻后加入初乳中，超聲勻化形成復(fù)乳。加入5%聚乙烯醇溶液，高速攪拌至乳化完全后，繼續(xù)在室溫下低速攪拌至CH2Cl2揮發(fā)完全，高速離心分離微球，用冷無菌三蒸水洗滌-離心共5次，常規(guī)凍干保存。觀測(cè)硫酸軟骨素酶ABC微球的形態(tài)，硫酸軟骨素酶ABC微球載藥量與包封率，硫酸軟骨素酶ABC微球的體外釋藥曲線。

4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)原則分為4組，每組10只。A組為硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植組，B組為自體神經(jīng)移植組，C組為改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)浸泡ChABC神經(jīng)移植對(duì)照組，D組為改良化學(xué)法去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植等滲0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組。

5 神經(jīng)移植段的制備 參考秦長(zhǎng)江等[2]改良化學(xué)去細(xì)胞方法處理坐骨神經(jīng)。取A、C、D 3組30只動(dòng)物，無菌、麻醉?xiàng)l件下在右側(cè)股后部正中切口，手術(shù)顯微鏡下解剖坐骨神經(jīng)，將坐骨神經(jīng)銳性切斷，長(zhǎng)度為10 mm，將兩斷端神經(jīng)外膜用9-0無損傷縫合線縫于周圍組織防止回縮。將切取的神經(jīng)用液氮反復(fù)凍融3次，隨后使用含SB-10的PBS液和含SB-16、Tritonx-200的PBS液進(jìn)行化學(xué)處理2次后，放入4℃無菌PBS液(pH 7.2)，以組為單位分別暫時(shí)保存。D組制備神經(jīng)浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH 7.4)中。

6 動(dòng)物模型建立 使用10%水合氯醛腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，在無菌操作下A組神經(jīng)缺損處取C組制備神經(jīng)行異體神經(jīng)移植，端端無張力外膜縫合。并在移植神經(jīng)段距近心端縫合處2 mm、4 mm、6 mm、8 mm處分別注入0.2 μl制備好的硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球，逐層關(guān)閉切口縫合。B組分離切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm，倒置后行外膜縫合。C組神經(jīng)缺損處取D組制備神經(jīng)行異體神經(jīng)移植。D組神經(jīng)缺損處取A組制備神經(jīng)行異體神經(jīng)移植，并按照A組的位置注入等量等滲0.9%氯化鈉注射液。術(shù)后每天給予慶大霉素4×104U肌注，連續(xù)3 d預(yù)防感染。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，不限制活動(dòng)。

7 電生理檢測(cè) 術(shù)后12周用肌電圖儀進(jìn)行檢測(cè)，刺激電極置于吻合口近側(cè)坐骨神經(jīng)，記錄電極置于脛前肌，記錄神經(jīng)肌肉動(dòng)作電位，比較運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期和波幅。在坐骨切跡插入刺激電極，在脛前肌插入記錄電極。記錄神經(jīng)干動(dòng)作電位波形，測(cè)定潛伏期、波幅、神經(jīng)傳導(dǎo)速度以及再生神經(jīng)軸突面積(刺激參數(shù)：細(xì)電壓、單刺激、波寬0.3 ms、延時(shí)0.5 ms、刺激強(qiáng)度1.5 V)。每隔1 min重復(fù)電刺激，3次取平均值。

8 組織學(xué)觀察 術(shù)后觀察各組動(dòng)物神經(jīng)吻合口有無膨大或神經(jīng)瘤形成、移植體及近遠(yuǎn)端神經(jīng)顏色光澤、與周圍組織有無粘連等。術(shù)后12周各組行電鏡組織學(xué)觀察再生神經(jīng)纖維情況。取兩端神經(jīng)移植段吻合口的組織，置于20%甲醛固定液中固定7 d后，脫水，石蠟包埋，4 ～ 6 μm半薄切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有實(shí)驗(yàn)室據(jù)用表示，多組間比較用單因素χ2分析，兩組間比較用LSD法進(jìn)行顯著性檢測(cè)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 微球制備情況 掃描電鏡下觀察，硫酸軟骨素酶ABC微球表面光滑，球體大小各異且均勻，無粘連及成簇等現(xiàn)象(圖1)。硫酸軟骨素酶ABC微球的載藥量、包封率及體外釋藥：共制得4批硫酸軟骨素酶ABC微球，平均載藥量(14.30±1.75)×10-3%，平均包封率(53.73±0.94)%，硫酸軟骨素酶ABC微球在3周內(nèi)的體外累積釋藥分?jǐn)?shù)為0.863 5，釋藥平穩(wěn)。見圖2。

2 動(dòng)物手術(shù)部位觀察 術(shù)后12周觀察手術(shù)部位。B組神經(jīng)斷端無明顯神經(jīng)瘤形成，移植段神經(jīng)顏色接近正常，與周圍組織基本無粘連。A、C、D 3組神經(jīng)斷端處均有再生神經(jīng)纖維通過，A組較另外兩組再生神經(jīng)直徑粗，其中D組與周圍組織粘連較其他兩組重，3組均未出現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)。見圖3。

3 電生理檢測(cè) B組傳導(dǎo)速度、再生軸突橫切面積等檢測(cè)指標(biāo)恢復(fù)均最明顯。A組恢復(fù)較好，但相較于B組有一定差距。C、D兩組恢復(fù)滯后，D組略好于C組。A、B兩組較C、D兩組再生神經(jīng)恢復(fù)率、再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率明顯提高(P＜0.05)，見表1、表2。

4 組織學(xué)觀察 術(shù)后12周4組神經(jīng)移植段HE染色均只有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)合鍍銀染色可見B組縱切片大量排列整齊的波浪狀纖維，橫切片可見再生神經(jīng)軸突排列整齊、密集，呈中央或小束狀分布，束間有少量疏松結(jié)締組織充填，可見有微小血管分布。A組再生神經(jīng)纖維排列規(guī)則，與B組相似，但較B組稀疏，其他表現(xiàn)基本相同。C、D兩組再生神經(jīng)軸突較少，銀復(fù)染再生的神經(jīng)纖維不如A、B兩組豐富。見圖4。

表1 各組動(dòng)作電位的潛伏期、波幅和傳導(dǎo)速度比較Tab. 1 Com parison of the incubation period, am plitude and conduction velocity of each group action potential (, n=10)

表1 各組動(dòng)作電位的潛伏期、波幅和傳導(dǎo)速度比較Tab. 1 Com parison of the incubation period, am plitude and conduction velocity of each group action potential (, n=10)

a P＜0.05, vs Group A; b P＜0.05, vs Group A

Group Latency (ms)Amplitude (mV)MCV (m/s) A 0.809±0.024 0.197±0.030 71.766±1.693 B 0.817±0.021 0.211±0.029 72.581±2.174 C 1.008±0.035a 0.138±0.027a 59.567±1.882a D 1.114±0.019b 0.122±0.013b 57.243±0.982b

表2 各組再生軸突橫切面積、再生神經(jīng)恢復(fù)率、再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率比較Tab. 2 Com parison of regeneration of axons crosscutting area, regeneration of nerve recovery rate and recovery rate of regeneration of nerve conduction speed (, n=10)

表2 各組再生軸突橫切面積、再生神經(jīng)恢復(fù)率、再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率比較Tab. 2 Com parison of regeneration of axons crosscutting area, regeneration of nerve recovery rate and recovery rate of regeneration of nerve conduction speed (, n=10)

a P＜0.05, vs Group A; b P＜0.05, vs Group A

Group Axons cross area (m2)Regeneration of nerve recovery rate (%) Regeneration of nerve conduction velocity recovery rate (%) A 0.477±0.030 63.60±4.00 68.35±1.61 B 0.485±0.031 64.67±4.13 69.12±2.07 C 0.348±0.026a 46.40±3.36a 56.73±1.99a D 0.337±0.043b 44.93±5.74b 54.52±0.93b

圖 1 掃描電鏡下硫酸軟骨素酶ABC微球形態(tài)Fig. 1 Scann ing electron m icroscope examination o f the chondroitinase ABC m icrospheres

圖 2 硫酸軟骨素酶ABC微球累積釋藥分?jǐn)?shù)的W eibull方程擬合曲線Fig. 2 Cu rve fitting o f cum u lative d rug release ratio o f chondroitinase ABC microspheres with Weibu ll equations

圖 3 術(shù)后12周大鼠坐骨神經(jīng)Fig. 3 Sciatic nerve of rats

圖 4 術(shù)后12周大鼠坐骨神經(jīng)HE染色，箭頭示郎飛結(jié)(×100)Fig. 4 Sciatic nerve HE staining of rats, arrow node of Ranvier(×100)

圖 5 術(shù)后12周掃描電鏡下大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞(×8 000)Fig. 5 Schwann cells in sciatic nerve in rats under the SEM (×8 000)

5 超微結(jié)構(gòu)觀察 術(shù)后12周A、B兩組電鏡下可見再生有髓軸突排列均勻密集，無髓神經(jīng)軸突散在分布，雪旺細(xì)胞(Schwann cell，SC)胞核明顯，軸突內(nèi)有線粒體、突觸小泡等細(xì)胞器，有突觸間隙和突觸皺襞形成，再生神經(jīng)纖維聚集成束，外包有神經(jīng)束膜。C、D兩組再生神經(jīng)軸突粗細(xì)不等，無髓纖維比有髓纖維多見，軸突之間可見一個(gè)或多個(gè)未成熟的雪旺細(xì)胞，髓鞘薄，線粒體不豐富。見圖5。

討 論

周圍神經(jīng)損傷后的治療與康復(fù)，歷來是創(chuàng)傷外科的重要研究課題?；仡欀車窠?jīng)損傷修復(fù)的發(fā)展歷史，大致可以分為3個(gè)階段：第1階段是神經(jīng)損傷處的機(jī)械與力學(xué)對(duì)合，強(qiáng)調(diào)神經(jīng)縫合處不能有張力，以免在縫合處斷端形成瘢痕，阻礙軸突的再生；第2階段是顯微外科技術(shù)在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用，由于在手術(shù)顯微鏡下可以清楚地看到神經(jīng)束的形態(tài)，從而使相同功能的神經(jīng)束得以精確對(duì)合，即“神經(jīng)束間縫合”；第3階段由于神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展、眾多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)趨化因子的發(fā)展與實(shí)驗(yàn)研究，闡明了上述各種因子在周圍神經(jīng)損傷后再生中的作用及神經(jīng)損傷后再生的機(jī)制，從而使周圍神經(jīng)損傷的治療與康復(fù)成為可能。

自體神經(jīng)移植被認(rèn)作周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然術(shù)后效果最佳，但不可避免的需要損傷自身其他相對(duì)次要神經(jīng)支。同理，用相似方法比如吻合血管、肌肉的神經(jīng)移植術(shù)也會(huì)損傷相應(yīng)組織。故異體神經(jīng)移植表現(xiàn)出強(qiáng)大的研究發(fā)展空間。異體神經(jīng)移植的最大障礙就是異體組織的免疫排斥反應(yīng)。所以20世紀(jì)以來，學(xué)者們采用各種方法來降低移植體的抗原性并一一做了深入研究，實(shí)驗(yàn)室效果令人滿意。

降低異體神經(jīng)抗原性方法較多，冷凍法、化學(xué)法、輻照法、藥物處理以及甘油處理等方法，效果各有不同[3-6]。本實(shí)驗(yàn)參考秦長(zhǎng)江等[2]、王偉等[1]的方法結(jié)合凍融和化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)制備去細(xì)胞異體神經(jīng)，凍融處理后的神經(jīng)其SC和髓鞘已破壞，降低了免疫原性，并完整保留了基底膜，再用化學(xué)試劑去除已崩解的SC及其髓鞘，進(jìn)一步降低了免疫原性，并最大限度保留基底膜成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沒有明顯的免疫排斥反應(yīng)，效果較為理想。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用此方法在操作過程及結(jié)果中均未出現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)，神經(jīng)移植段與周圍組織粘連較輕，且僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。此方法在本實(shí)驗(yàn)中效果明顯并達(dá)到預(yù)期效果，也進(jìn)一步驗(yàn)證了此方法的可靠性。

研究表明利用化學(xué)法可有效去除同種異體神經(jīng)中的雪旺細(xì)胞，降低移植宿主的免疫反應(yīng)，同時(shí)保留較完整的細(xì)胞外基質(zhì)，主要包括層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖等。雖然層粘連蛋白、纖維粘連蛋白有促進(jìn)軸突再生的作用，但越來越多的證據(jù)表明CSPG能夠抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，有抑制細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用[7]。如何增加周圍神經(jīng)損傷后胞外基質(zhì)中促進(jìn)軸突再生的分子，去除抑制分子，對(duì)于神經(jīng)的再生具有重要的意義。周圍神經(jīng)系統(tǒng)中含有豐富的CSPG，CSPG由多種核心蛋白和與核心蛋白相連的葡糖胺聚糖(glucosaminoglycan，GAG)側(cè)鏈組成，當(dāng)其結(jié)構(gòu)完整時(shí)，才能抑制神經(jīng)生長(zhǎng)，因此分解其GAG側(cè)鏈或溶解其核心蛋白都會(huì)消除這種抑制作用。硫酸軟骨素酶ABC因其酶解作用部位的高度特異性和局限性，且生物相容性好、不良反應(yīng)小，已用于脊柱等局部藥物治療的臨床研究中[8]。

硫酸軟骨素酶ABC是一種細(xì)菌胞外酶，它能特異性消化CSPG的GAG鏈，保留其蛋白核心。用ChABC消化GAG側(cè)鏈后，體外培養(yǎng)的神經(jīng)元在CSPG底物上延伸軸突的能力明顯提高[9-10]。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)ChABC可降解CSPG，促進(jìn)神經(jīng)再生。并有研究表明，神經(jīng)套接實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ChABC可以適當(dāng)延長(zhǎng)神經(jīng)斷端間隙長(zhǎng)度[11]。硫酸軟骨素酶ABC在體內(nèi)容易失活，需局部長(zhǎng)期用藥，目前采用的用藥方式均有不足之處。而緩釋微球這種給藥方式已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種試驗(yàn)當(dāng)中，是一種長(zhǎng)期給藥的良好途徑。制備緩釋微球的過程中，首先要考慮的是預(yù)期的微球釋藥時(shí)間。時(shí)間太短或太長(zhǎng)都不能發(fā)揮藥物效能，失去使用此方法的意義。針對(duì)神經(jīng)損傷區(qū)CSPG其核心蛋白表達(dá)在14 d達(dá)峰值，糖胺多糖鏈持續(xù)時(shí)間達(dá)損傷后40 d以上的特點(diǎn)制備緩釋微球，能夠更好地去除掉胞外基質(zhì)中的CSPG，有效地促進(jìn)神經(jīng)的再生和修復(fù)[12]。王紅輝等[13]用甲殼素橋接神經(jīng)斷端后，在管內(nèi)注入ChABC-PLGA，表明硫酸軟骨素酶ABC具有促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的作用。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ChABC緩釋微球，體外檢測(cè)藥物釋放的高峰值為3周左右，能夠針對(duì)CSPG的特點(diǎn)發(fā)揮效力。A組應(yīng)用硫酸軟骨素酶ABC緩釋微球處理移植神經(jīng)段，去除CSPG程度最高、最徹底；而C組使用硫酸軟骨素酶ABC浸泡移植神經(jīng)段，雖部分去除CSPG，但程度不高且不夠徹底。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明應(yīng)用ChABC緩釋微球組神經(jīng)生長(zhǎng)速度、軸突再生能力均優(yōu)于未使用的陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)證明了ChABC能夠提高軸突的生長(zhǎng)速度，有效地促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生修復(fù)和功能恢復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用改良化學(xué)法制備同種異體神經(jīng)進(jìn)行大鼠坐骨神經(jīng)移植，未出現(xiàn)明顯免疫排斥反應(yīng)。應(yīng)用硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球組較未使用組，神經(jīng)再生及修復(fù)的速度和質(zhì)量均明顯提高。

1 張德盛，鐘德君，宋躍明，等．硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球的制備及其體外性質(zhì)［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（32）：6247-6250．

2 秦長(zhǎng)江，王偉，李宏義，等．改良去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植后免疫反應(yīng)的觀察［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2006，14（4）：340-343.

3 Fox IK， Jaramillo A， Hunter DA，et al. Prolonged cold-preservation of nerve allografts［J］. Muscle Nerve， 2005， 31（1）： 59-69.

4 Niapour A， Karamali F， Karbalaie K，et al. Novel method to obtain highly enriched cultures of adult rat Schwann cells［J］. Biotechnol Lett， 2010， 32（6）： 781-786.

5 Zhang LX， Tong XJ， Sun XH，et al. Experimental study of low dose ultrashortwave promoting nerve regeneration after acellular nerve allografts repairing the sciatic nerve gap of rats［J］. Cell Mol Neurobiol， 2008， 28（4）： 501-509.

6 連霄飛，王偉，張力，等．他克莫司與肌源性干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)去細(xì)胞異體神經(jīng)支架移植后神經(jīng)再生和修復(fù)作用的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（3）：389-392．

7 Muir D. The potentiation of peripheral nerve sheaths in regeneration and repair［J］. Exp Neurol， 2010， 223（1）： 102-111.

8 Chiba K， Masuda K， Andersson GB，et al. Matrix replenishment by intervertebral disc cells after chemonucleolysis in vitro with chondroitinase ABC and chymopapain［J］. Spine J， 2007， 7（6）：694-700.

9 趙斌，王玉，彭江，等．軟骨素酶ABC處理化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)后的形態(tài)學(xué)觀察［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2010，18（18）：1547-1549．

10 于海龍，彭江，盧世璧，等．軟骨素酶ABC去除化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)中硫酸軟骨素蛋白多糖［J］.神經(jīng)損傷與功能重建，2012，7（1）：19-23．

11 于海龍，彭江，盧世璧，等．軟骨素酶ABC 增加化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)修復(fù)神經(jīng)缺損長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2011，5（19）：5604-5607．

12 Iaci JF， Vecchione AM， Zimber MP，et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in spinal cord contusion injury and the effects of chondroitinase treatment［J］. J Neurotrauma， 2007， 24（11）：1743-1759.

13 王紅輝，陳清漢，楊延良．硫酸軟骨素酶ABC（chABC）對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生功能的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2011，14（3）：21-23．

Repairing sciatic nerve in rats by acellular allogeneic nerve transplantation treated with chondroitinase ABC-PLGA microspheres

YU Guang-ming1, WANG Wei2, ZHANG Li2, ZHANG De-long1
1Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Jinzhou Central Hospital, Jinzhou 121013, Liaoning Province, China
Corresponding author: WANG Wei． Email: W eiw ang_Ly@yahoo．com．cn

ObjectiveTo investigate the feasibility of repairing sciatic nerve in rats by acellular allogeneic nerve transp lantation treated with chondroitinase ABC-PLGA m icrospheres．MethodsChondroitinase ABC-PLGA m icrospheres w ere prepared by double emulsion methods． Forty adult male SD rats were randomly selected and divided into four groups (n=10): freeze-thrawed combined optim ized acellular nerve (FTOAN) group treated with chondroitinase ABC-PLGA m icrospheres (Group A), autologous nerve transp lantation group (Group B), FTOAN soaking chondroitinase ABC group (Group C), FTOAN treated with normal saline group (Group D)． Ten m illimeters of nerve from the right sciatic nerve of animals in three groups (Group A, C, D) was artif cially cut and transp lanted with FTOAN． Group A and C w ere soaked in PBS, w hile group D w ere soaked in PBS solution containing 2 U/ml ChABC (pH 7．4)． Preparation line nerve of group C was taken by animals in group A and allograft nerve grafts were taken in both two groups, the outer membrane was sutured without tension, and preparated chondroitinase ABC-PLGA m icrospheres accounting for 0．2 μl was injected in the transp lanted neural segments from the seam s of proximal part of 2 mm, 4 mm, 6 mm, 8 mm respectively．Outer membrane suture w as taken by group B on the right side of 10 mm broken sciatic nerve after inversion． Preparation line nerve of group D w as taken by animals in group C and nerve-grafting w as taken in both tw o groups． Group D made allograft nerve grafts with preparation line nerve of group A, and equal amount of isotonic saline w as injected according to the position of group A． Gross specimen was observed 4,8,12 w eeks after operation． Electrophysiological detection, HE staining, silver staining, electron m icroscope histological detection and image analysis w ere compared 12 w eeks after operation．ResultsThe preparated chondroitinase ABC m icrospheres had smooth surface and sphere uniform sizes, and no adhesion and clusters w ere found． W eibull equation curve show edthe stability of in vitro release of chondroitinase ABC-PLGA microspheres． The axonal regeneration of neural defect in rats could be promoted by freeze-thrawed combined optim ized acellular nerve group treated with chondroitinase ABC-PLGA microspheres, the quality and speed of nerve repairing were also improved． The regeneration nerve was thicker in diameter and lighter in adhesion．Electrophysiological detection and histology observation showed that all indicators were better than the two compared groups, and also the repair effect was much closer to autologous nerve grafts．ConclusionFreeze-thrawed combined optimized acellular nerve group treated with chondroitinase ABC-PLGA microspheres can repair the nerve injury in rats．

peripheral nerve injury; chondroitinase ABC; chem ically acellular nerve allograft; rats

R 617

A

2095-5227(2014)08-0858-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.023

2014-04-25 08:34

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140425.0834.001.html

2013-11-25

于光明，男，在讀碩士。研究方向：周圍神經(jīng)損傷修復(fù)。Email: 786741601@qq.com

王偉，男，博士，出站博士后，教授。Email: Weiwang_Ly@yahoo.com.cn