馮秀紅 曹建偉 陸巧芬 馮開容 陳修鄧 劉廣芹 關(guān)建新

（廣東省江門市動物疫病預(yù)防控制中心 廣東江門 529000）

自2013年4月報(bào)道人感染H7N9流感以來，禽流感疫病的防控與監(jiān)測再一次引起社會各界的關(guān)注[1-2]。用于禽流感病毒的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的病毒分離鑒定、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等，其中分子生物學(xué)方法有著靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前禽流感病毒檢測的主要發(fā)展方向[3]。江門市動物疫病預(yù)防控制中心在嚴(yán)格進(jìn)行日常的禽流感疫病監(jiān)控的同時(shí)，通過增加對活禽批發(fā)市場的抽樣檢測數(shù)量，及時(shí)監(jiān)測并掌握疫病特別是禽流感疫病的流行及發(fā)展動態(tài)。對于所采集到的禽流感樣品，如，咽/泄殖腔拭子、環(huán)境樣品等，從經(jīng)濟(jì)、方便和快捷的角度考慮，疫控中心一向選用膠體金方法進(jìn)行檢驗(yàn)。但面對來勢洶洶的禽流感，要提高檢測的準(zhǔn)確度和檢測速度就要求采用檢測結(jié)果更準(zhǔn)確的國標(biāo)熒光RT-PCR法，此法具有用樣少、特異性強(qiáng)、敏感性高及快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，大大縮短了對AIV的檢出時(shí)間，為我國禽流感的綜合防制提供了先進(jìn)、有效的早期快速診斷技術(shù)[4]。

本著“公正、科學(xué)、準(zhǔn)確、高效”的實(shí)驗(yàn)室管理方針，為確保對禽流感疫病檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，自2013年10月起，實(shí)驗(yàn)室就嘗試采用不同的檢測方法進(jìn)行比對試驗(yàn)，通過對江門市區(qū)內(nèi)耙沖市場、江南批發(fā)市場及新會奇榜市場3個(gè)活禽交易批發(fā)市場每月2次隨機(jī)定量抽樣，然后對抽取的樣品采用膠體金與國標(biāo)熒光RT-PCR2種方法進(jìn)行檢測結(jié)果比對試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析選取最合適的實(shí)驗(yàn)檢測方法。得出結(jié)論是為了確保檢測的準(zhǔn)確性，在重要和關(guān)鍵時(shí)期，選用熒光RT-PCR樣品進(jìn)行檢測是比較合適的。膠體金法檢測相對熒光RT-PCR法有一定漏檢和誤檢現(xiàn)象，只適用于正常時(shí)期的一般性檢測。

1 研究內(nèi)容

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品采集要求：每月隨機(jī)2次，到3個(gè)市場采集至少3個(gè)不同品種的禽只各10份咽/泄殖腔拭子[5]、10份環(huán)境樣品（混樣）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

禽流感快速檢測條（廣州瑞森生物科技有限公司），韓國Anigen禽流感快速診斷試劑卡（韓國Anigen），禽流感病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒（深圳澳東檢驗(yàn)檢測科技有限公司），內(nèi)含RNA提取液、反應(yīng)液、陽性對照、陰性對照、tap酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RT-PCR反應(yīng)液和DEPC水；自備：氯仿、異丙醇和75%酒精。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光RT－PCR法(參照禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法（GB/T19438.2-2004）)

（1）取若干個(gè)Eppendorft管，分別加入陰陽對照和已處理的樣品200μL，加入裂解液600μL，吸打混勻，再加入200μL氯仿，振蕩混勻，靜置5min，12000rpm離心10min。

（2）吸取上層液相轉(zhuǎn)入新的eppendorft 管 中 ， 再 加 入400μL-20℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，靜置5min，12000rpm離心10min。

（3） 輕輕倒去上清，加入700μL75%乙醇，顛倒?jié)櫹磶状危?2000rpm離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。

（4）4000rpm離心10s，用微量移液器盡量將殘余液體吸干，室溫干燥1～5min。

（5）加入15μLDEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上的RNA，-18℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）每份總體積25μL。取19μLRT-PCR反應(yīng)液 (用前混勻)、0.5μLtap酶、0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶，5μL樣品RNA。反應(yīng)體系配制如表1。

（7）取20μL反應(yīng)體系配制液，分裝成n份，分別加入5μL樣品RNA。做好標(biāo)記，在熒光PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：50℃20min，95℃3min；擴(kuò) 增 條 件 為95℃5s，55℃20s，72℃20s，5個(gè)循環(huán)95℃5s，60℃40s，40個(gè)循環(huán)，在60℃處收集熒光。

1.3.2 膠體金法

操作方法[6]：將采集樣品浸入樣品稀釋液，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，靜置少許時(shí)間，用一次性滴管取上清液（樣品若不能立即測試，應(yīng)冷藏保存，超過24小時(shí)，應(yīng)冷凍保存）。將未開封的試紙卡和檢測樣品恢復(fù)至室溫。將試紙卡水平放置，用滴管向試卡孔緩慢逐滴加入3滴不含氣泡的檢測液，5分鐘判斷結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

膠體金法和熒光RT-PCR法檢測3次（91、96、96份）拭子抗原，結(jié)果見表2、表3和表4。

（1）由表1可見，2013年10月15日91份拭子，用膠體金法（瑞森）檢測禽流感抗原，陽性23份，陽性率25.27%；用熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原，陽性21份，陽性率23.08%。2013年11月5日96份拭子，用膠體金法（瑞森）檢測禽流感抗原，陽性23份，陽性率23.96%；用膠體金法（韓國Anigen）檢測禽流感抗原，陽性0份，陽性率0；用熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原，陽性22份，陽性率22.92%。2013年11月12日96份拭子，用膠體金法（韓國Anigen）檢測禽流感抗原，陽性1份，陽性率1.04%；用熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原，陽性22份，陽性率22.92%。

表1 反應(yīng)體系

表2 膠體金法和熒光RT-PCRifc檢測禽流感抗原結(jié)果數(shù)據(jù)匯總

表3 膠體金法（瑞森）和熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原結(jié)果符合情況

表4 膠體金法（韓國Anigen）和熒光RT-PCR法檢測禽流感抗原結(jié)果符合情況

（2）由表2可見，2種方法檢測結(jié)果不相符的有81份。其中38份膠體金法（瑞森）為陰性，熒光RT-PCR法檢測為陽性；43份體金法（瑞森）為陽性，熒光RT-PCR法檢測為陰性。由表3可見，2種方法檢測結(jié)果不相符的有85份。其中44份膠體金法（韓國Anigen）為陰性，熒光RT-PCR法檢測為陽性；1份膠體金法（韓國Anigen）為陽性，熒光RT-PCR法檢測為陰性。膠體金法檢測相對熒光RT-PCR法有一定漏檢和誤檢現(xiàn)象存在。

（3）由表2可見，相對熒光RT-PCR法檢測，膠體金法（瑞森）檢測陽性（a）為3份，陰性（d）為103份，假陽性（b）為43份，假陰性（c）為38份。膠體金法檢測靈敏度＝a/(a+c)×100%＝7.32%；特異度＝d/(b+d)×100%＝70.55%；漏檢率＝c/(a+c)×100%=92.68%;誤診率＝b/(b+d)×100%＝29.45%；診斷符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100%＝56.68%。由表3可見，相對熒光RT-PCR法檢測，膠體金法（韓國Anigen）檢測陽性（a）為0份，陰性（d）為147份，假陽性（b）為1份，假陰性（c）為44份。膠體金法檢測靈敏度＝a/(a+c)×100%＝0%；特異度＝d/(b+d)×100%＝99.32%；漏檢率＝c/(a+c)×100%=100%;誤診率＝b/(b+d)×100%＝0.67%； 診斷符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100%＝76.56%。

（4）從分析可知，兩家公司的速測條檢測結(jié)果假陰與假陽性情況都比較嚴(yán)重，假陽性使正常健康的禽只被誤診為患病禽只，這對養(yǎng)殖戶與銷售檔主都可能帶來不必要的損失，而假陰性使患病禽只被誤診為正常健康禽只，則不能及時(shí)有效地發(fā)現(xiàn)疫病的發(fā)生并杜絕疫病的傳播，這對于禽流感疫病的監(jiān)測防控是一個(gè)嚴(yán)重的漏洞。

（5）膠體金法因其使用方便，檢測時(shí)間短，而且成本較低，面對大量檢測的樣品，可以相對降低實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的支出，節(jié)省時(shí)間，但結(jié)果誤差率較大，尤其是假陽性率過高；熒光RT-PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但其試劑相對較貴，實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)硬件要求高，面對大量檢測時(shí)，在時(shí)間與經(jīng)費(fèi)方面考慮，都存在實(shí)質(zhì)性的可行性操作問題。為了確保檢測的準(zhǔn)確性，在重要和關(guān)鍵時(shí)期，選用熒光RT-PCR樣品進(jìn)行檢測是比較合適的。這次研究試驗(yàn)為今后的工作開展指明了方向。

[1]孫國根，記者王春項(xiàng)錚，發(fā)現(xiàn)新型人感染H7N9禽流感病毒[N].科技日報(bào)，2013年4月13日第001版.

[2]通訊員朱海洋，記者潘劍凱，H7N9禽流感研究取得重大突破[N].光明日報(bào)，2013年4月28日第002版.

[3]柯艷坤，陳曉春，齊巖，等.禽流感病毒檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國家禽，2008年第30卷第14期.

[4]EspyMJ,UhlJR,SloanLM,etal.Real-timePCRinclinicalmicrobiology:applicationsforroutine laboratorytesting[J].ClinMicrobiol Rev,2006,19(1):1652256.

[5]包紅梅，王秀榮，劉麗玲，等.禽流感病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2006,36(09):701-706.

[6]彭伏虎，胡思順，王政，等.通用型禽流感病毒膠體金快速檢測試紙條的研制與應(yīng)用研究[C].首屆中國獸藥大會——獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集（2008）.

[7]向林遠(yuǎn)，杜國芹.膠體金法與ELISA法檢測豬瘟抗體結(jié)果對比分析[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2012年7月10日第8期.