葉麗華，夏 飛，李 欣，江必武，王 平

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢 430030；2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，武漢 430060；3.武漢市第一醫(yī)院漢西分院消化內(nèi)科，武漢 430034）

黃芪對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子調(diào)控表達(dá)及菌體運(yùn)動(dòng)的影響*

葉麗華1，夏 飛2，李 欣3，江必武3，王 平3

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢 430030；2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，武漢 430060；3.武漢市第一醫(yī)院漢西分院消化內(nèi)科，武漢 430034）

摘要：[目的]觀察黃芪對(duì)銅綠假單胞菌相關(guān)毒力因子表達(dá)及菌體運(yùn)動(dòng)的影響，探討黃芪對(duì)銅綠假單胞菌的作用機(jī)制。[方法]不同濃度黃芪與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期銅綠假單胞菌共培養(yǎng)，彈性蛋白-剛果紅降解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌分泌的彈性蛋白酶活性，紫外分光光度法測(cè)定綠膿菌素分泌量，結(jié)晶紫染色法觀察生物被膜形成量，在含黃芪瓊脂平板中檢測(cè)菌體集群運(yùn)動(dòng)與泳動(dòng)能力。[結(jié)果]黃芪在終濃度25、12.5、6.25 g/L條件下對(duì)彈性蛋白酶、綠膿菌素表達(dá)有顯著抑制，并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L時(shí)對(duì)細(xì)菌增殖無(wú)顯著影響。細(xì)菌在12.5 g/L條件下泳動(dòng)能力與集群運(yùn)動(dòng)均受到顯著影響。[結(jié)論]黃芪對(duì)銅綠假單胞菌增殖和毒力因子表達(dá)的抑制程度不一致，提示黃芪抑菌可能通過(guò)多種途徑發(fā)揮抑菌功能，并可能在低濃度下便對(duì)密度感應(yīng)系統(tǒng)造成顯著抑制。

關(guān)鍵詞：彈性蛋白酶；綠膿菌素；生物被膜；菌體運(yùn)動(dòng)；黃芪

銅綠假單胞菌（PA）是臨床上常見(jiàn)院內(nèi)獲得性感染條件致病菌之一，能產(chǎn)生釋放多種毒力因子，如外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖等[1]。該菌能借助分泌物形成生物被膜（BF）并依靠菌體運(yùn)動(dòng)器官完成多種細(xì)菌運(yùn)動(dòng)如集群運(yùn)動(dòng)、涌動(dòng)等。利用生物膜-浮游態(tài)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致感染擴(kuò)散、毒素播散和全身炎癥反應(yīng)綜合征，加之抗生素的亂用和濫用，導(dǎo)致多重耐藥或泛耐藥菌株的出現(xiàn)，部分患者由于無(wú)藥可用而死于感染。隨著“抗生素后時(shí)代”的到來(lái)，人們開(kāi)始更多地求助于非抗生素治療。中藥迄今已有兩千多年的歷史，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)有多種中藥具有抑菌殺菌的功效[2-3]，黃芪是臨床上常用的一味中藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、保肝、利尿和廣泛的抗菌作用。因此本實(shí)驗(yàn)選用黃芪粉作用PA，觀察其對(duì)毒力因子表達(dá)與菌體運(yùn)動(dòng)的影響，探討作用機(jī)制，為臨床細(xì)菌感染的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養(yǎng)液 野生標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1株為本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)液：LB培養(yǎng)液，含1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉。

1.2 試劑與試液 0.2 mol/L鹽酸溶液，10 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液，剛果紅彈性蛋白（美國(guó)Sigma公司），黃芪顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司，1205182，每袋1.5 g。

1.3 瓊脂平板 LB培養(yǎng)基配制成0.3%、0.5%瓊脂懸液，高壓滅菌后備用。配制500g/3L黃芪粉末懸液，裝入玻璃瓶，100℃水浴40 min后離心，5 000 r/min，分別取上清液1.5 mL加入平碟內(nèi)，各加入融化的0.3%、0.5%瓊脂20 mL，混勻固化后備用。平碟內(nèi)黃芪藥液終濃度為12.5 g/L。0.5%瓊脂平板使用前倒置于30℃過(guò)夜。

1.4 實(shí)驗(yàn)器材 紫外分光光度計(jì)（HITACHU-2900、Amersham Genequant pro），蘇泰生物安全柜，恒溫?fù)u床，硅膠管。

1.5 黃芪對(duì)PA生長(zhǎng)的影響 PAO1菌培養(yǎng)過(guò)夜，用LB培養(yǎng)液稀釋A600為0.6后加入玻管，3.0mL/管；配制1200g/6L的黃芪懸液，玻管內(nèi)100℃水浴40 min后，5 000 r/min，取上清用LB培養(yǎng)基稀釋為100、50、25和12.5 g/L。取上述不同濃度藥液分別加入含有菌液的玻璃管中，1.0 mL/管。加入后使菌懸液中黃芪終濃度為50、25、12.5、6.25、3.12 g/L。陰性對(duì)照組加入1 mL LB培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立黃芪懸液對(duì)照。37℃培養(yǎng)、150 r/min，24 h。測(cè)定A600值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 綠膿菌素分泌檢測(cè) 收集上述菌液離心，16 000×g 5 min取上清，加入2.0 mL氯仿，分離下層溶液并加入0.2 mol/L HCL 0.8 mL，取上層液體離心，16 000×g 2min，取上清測(cè)定A520值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[4]。

1.7 彈性蛋白酶檢測(cè)[5]收集上述菌液上清，每管取80 μL備用，取60 μL加入到800 μL Na2HPO4溶液中（含1 g/L剛果紅彈性蛋白），37℃反應(yīng)18 h。反應(yīng)完成后離心，16 000×g 5 min，取上清測(cè)A495值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 BF形成能力檢測(cè) 準(zhǔn)備2 cm長(zhǎng)硅膠管高壓滅菌后置玻管內(nèi)，加入A600值0.6菌液3.0 mL，分別加入上述濃度藥液1.0 mL，每梯度3管，37℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)到期后取出硅膠管至空白玻璃管內(nèi)用蒸餾水清洗殘留浮游菌3次，用1%結(jié)晶紫室溫孵育15 min，用蒸餾水清洗3次后加入2 mL 95%乙醇洗滌，測(cè)定A540值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[5]。

1.9 集群運(yùn)動(dòng)與泳動(dòng)能力檢測(cè) 根據(jù)前期檢測(cè)結(jié)果分別制備含12.5 g/L黃芪藥液的0.3%與0.5%瓊脂平皿。取培養(yǎng)過(guò)夜菌液A6001.5接種，集群運(yùn)動(dòng)接種于瓊脂層表面，每板1.0 μL，泳動(dòng)接種于瓊脂中層，每板0.6 μL[6-7]。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BF檢測(cè) BF的A540值顯示50 g/L組生物膜形成弱于其余各組，3.12 g/L組生物膜形成與陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 黃芪對(duì)PA生長(zhǎng)的影響 本次實(shí)驗(yàn)中PA的A600值隨著黃芪濃度的升高而逐漸增加。其中50 g/L和25 g/L的A600值顯著高于其余各組，12.5、6.25、3.12 g/L組與空白對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同濃度黃芪對(duì)PA的BF起始量的影響（x±s，n=3）Tab.1 Effects of Astragalus mongholicus on the initiation of PA biofilms（x±s，n=3）

2.3 綠膿菌素與彈性蛋白酶分泌檢測(cè) 各組綠膿菌素A520值與彈性蛋白酶A495值隨著黃芪濃度的增加而逐漸降低，50 g/L組綠膿菌素與彈性蛋白酶分泌量均低于其余各組，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 集群運(yùn)動(dòng)與泳動(dòng)能力檢測(cè) 選取12.5 g/L黃芪濃度制備瓊脂平板。37℃孵育24 h后可見(jiàn)0.3%瓊脂平皿中黃芪組泳動(dòng)能力弱于陰性對(duì)照組。0.5%集群運(yùn)動(dòng)平皿中陰性對(duì)照組泳動(dòng)面積顯著略大于黃芪組，培養(yǎng)24、48、72 h仍呈現(xiàn)此結(jié)果，見(jiàn)圖1。

3 討論

近年來(lái)中藥已成為研究抗菌抑菌藥物的來(lái)源之一，其優(yōu)勢(shì)在于中藥某些成分具有天然抗菌抑菌活性，這已在中醫(yī)學(xué)典籍與長(zhǎng)期臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中得到證實(shí)[8-10]，如具有補(bǔ)氣清熱解毒、利濕通淋類(lèi)作用的黃芪、黃連等多種中藥具有不同程度的抑菌作用。此外，通過(guò)現(xiàn)代科技還可提取有效成分并在其基本結(jié)構(gòu)上加以改造。在細(xì)菌抗生素耐藥壓力與日俱增的背景下，利用中藥配以低劑量抗生素協(xié)同殺菌抑菌的研究日漸增多。

本實(shí)驗(yàn)中筆者選擇黃芪體外作用于PA，觀察是否能夠?qū)A毒力因子、BF以及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PA的吸光度A600隨著黃芪濃度增加而升高。實(shí)驗(yàn)組與黃芪對(duì)照組的吸光度差值有隨著黃芪濃度增加而升高的趨勢(shì)，這表明高濃度黃芪提取液對(duì)吸光度造成干擾。同時(shí)低濃度黃芪對(duì)照組間吸光度值無(wú)顯著差異顯示這種干擾程度在此范圍內(nèi)較為恒定，細(xì)菌吸光度數(shù)值在低黃芪濃度范圍內(nèi)與正常對(duì)照無(wú)顯著差異。

表2 不同濃度黃芪對(duì)PA生長(zhǎng)的影響（x±s，n=3）Tab.2 Effects of Astragalus mongholicus at different concentration on growth of PA（x±s，n=3）g/L

表3 綠膿菌素與彈性蛋白酶的檢測(cè)結(jié)果（x±s，n=3）Tab.3 Effects of Astragalus mongholicus on production of pyocyanin and lastase（x±s，n=3）g/L

圖1 12.5 g/L黃芪對(duì)PA泳動(dòng)與集群運(yùn)動(dòng)的影響Fig.1 Effects of Astragalus mongholicus of 12.5 g/L onswimming and swarming of PA

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌毒力因子在黃芪作用下不同程度地受到抑制，特別是低于12.5 g/L時(shí)，黃芪提取液吸光度無(wú)顯著變化，細(xì)菌濃度也無(wú)顯著增加，這表明低濃度黃芪提取液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。此時(shí)毒力因子的抑制機(jī)制可能為非生長(zhǎng)抑制途徑。Schabel等[5]的研究表明彈性蛋白酶受到Las密度感應(yīng)系統(tǒng)（QS）的嚴(yán)格調(diào)控，QS系統(tǒng)激活之前只有非常低水平的表達(dá)，彈性蛋白酶缺失意味著QS系統(tǒng)單一或者雙缺陷。在筆者前期研究中已將彈性蛋白酶的表達(dá)作為判斷QS系統(tǒng)突變或缺失的標(biāo)準(zhǔn)并已進(jìn)行了基因水平的驗(yàn)證，這也提示當(dāng)QS系統(tǒng)受到抑制時(shí)其彈性蛋白酶的表達(dá)也會(huì)受到抑制。QS系統(tǒng)也參與BF的分化與成熟，特別是BF的微克隆分化需要3OC12-高絲氨酸內(nèi)酯（3OC12-HSL）分子，lasI基因一旦突變，PA就只能形成扁平、均一不分化的生物膜，而不能形成成熟的三維立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入合成的信號(hào)分子3OC12-HSL共同培養(yǎng)后，能使突變株恢復(fù)形成成熟生物膜的能力[11]。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的實(shí)驗(yàn)組黃芪同樣能抑制BF的起始，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

基于以上結(jié)果，筆者選取12.5 g/L黃芪開(kāi)展泳動(dòng)和集群運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。有報(bào)導(dǎo)表明泳動(dòng)與集群運(yùn)動(dòng)主要依賴細(xì)菌鞭毛[12]，泳動(dòng)來(lái)自細(xì)菌菌毛與鞭毛的協(xié)同作用，集群運(yùn)動(dòng)主要來(lái)自鞭毛運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在12.5 g/L黃芪作用下，細(xì)菌泳動(dòng)與集群運(yùn)動(dòng)均受到顯著抑制。這表明QS系統(tǒng)不僅對(duì)毒力因子的表達(dá)具有不同程度的調(diào)控作用，同時(shí)還能影響細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)，包括BF的形成。

本次實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)黃芪從多個(gè)方面對(duì)PA的毒力因子、BF和運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生廣泛抑制，因此這種抑制有可能在低濃度條件下對(duì)QS系統(tǒng)產(chǎn)生抑制而在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。這種機(jī)制可能來(lái)自對(duì)QS系統(tǒng)的多個(gè)層面的抑制。如從紅藻Delisea pulchra發(fā)現(xiàn)的溴化呋喃[13]因其結(jié)構(gòu)與AHL分子相似而發(fā)揮干擾QS信號(hào)交流系統(tǒng)傳遞的作用，又如從大蒜提取物中發(fā)現(xiàn)至少含有3種不同的QS抑制物,其中的一種已被鑒定為環(huán)狀二硫化合物[14],這種QS抑制物對(duì)以LuxR為基礎(chǔ)的QS發(fā)揮強(qiáng)烈抑制作用。這些天然QS抑制物的作用機(jī)制為研究黃芪QS抑制機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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（本文編輯：高 杉，于春泉）

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1519（2014）02-0113-04

收稿日期：（2013-08-10）

*基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011CDB302），武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（WX12A06）。

作者簡(jiǎn)介：葉麗華（1970-），碩士，主管護(hù)師，主要從事感染性疾病研究。

通訊作者：王 平，E-mail:13986271869@139.com。

Effects of Astragalus mongholicus on expression of pseudomonas aeruginosa virulence factors and somatic motility

YE Li-hua1，XIA Fei2，LI Xin3,JIANG Bi-wu3,WANG Ping3
（1.Department of Infectious Diseases,Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Wuhan Institute of Biological Institute Co.,Ltd.,Wuhan 430060,China;3.Department of Gastroenterology,Hanxi Branch of Wuhan First Hospital,Wuhan 430034,China）

Abstract:[Objective]To investigate the effects of Astragalus mongholicus on virulence factor of pseudomonas aeruginosa(PA)virulence and somatic motility and explore its mechanism.[Methods]The elastase activity was assessed quantitatively by elastin-Congo red degradation;the secretion of pyocyanin was determined with ultraviolet spectrophotometry after co-culture of different concentration of Astragalus mongholicus and PA at heterogonous grow phase;the biofilm formation was detected by crystal violet staining.The assay of somatic swarming was conducted in petri dishes,containing Astragalus mongholicus.[Results]The expression of elastase and pyocyanin were obviously inhibited at the concentration of 25 g/L,12.5 g/L and 6.25 g/L of Astragalus mongholicus and the biofilm formation was also inhibited.No effect on bacterial hyperplasia was found under 12.5 g/L.But the swimming and swarming motility of bacteria were reduced at 12.5 g/L.[Conclusion]Astragalus mongholicus can inhibit the hyperplasia and virulence factor of PA at different levels,indicating that the inhibition is controlled by multiple mechanisms,and the quorum sensing system can regulate these factors at a lower concentration of cultivation.

Key words：elastase;pyocyanin;biofilm;somatic motility;Astragalus mongholicus