張密霞，張德生，莊朋偉，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型的影響*

張密霞，張德生，莊朋偉，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

摘要：[目的]探討茯苓多糖對B16黑色素瘤小鼠人工肺轉(zhuǎn)移的影響，并對其作用機制進行初步研究。[方法] C57BL/6小鼠接種B16黑色素瘤，分為茯苓多糖高、低劑量組、順鉑組、模型組，茯苓多糖高、低劑量組分別給予每只小鼠茯苓多糖0.5 mg、0.33 mg，順鉑組給予順鉑0.04 mg，模型組給予生理鹽水，接種瘤細胞后第2天開始尾靜脈注射給藥，隔天給藥1次。觀察小鼠一般狀態(tài)，造模后21 d取肺，計數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)、HE染色檢測肺微小轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，并檢測外周血白細胞數(shù)量及脾質(zhì)量、脾指數(shù)。[結(jié)果]順鉑能夠抑制肺轉(zhuǎn)移，同時降低小鼠體質(zhì)量、外周血白細胞數(shù)量、脾質(zhì)量和脾指數(shù)。而茯苓多糖高、低劑量組對B16荷瘤鼠的體質(zhì)量無明顯影響，茯苓多糖高劑量可明顯降低肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，茯苓多糖高、低劑量可減少肺微小轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，高劑量組外周血白細胞數(shù)量明顯降低，低劑量組與模型組無統(tǒng)計學差異，低劑量可增加B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)，高劑量對B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)無明顯影響。茯苓多糖高、低劑量組脾質(zhì)量和脾指數(shù)均高于順鉑組。[結(jié)論]茯苓多糖能夠抑制尾靜脈注射B16荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移，增加其脾質(zhì)量和脾指數(shù)，無明顯增加其外周血白細胞數(shù)量的作用，推測活化外周血白細胞，增強免疫功能可能參與茯苓多糖抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。

關(guān)鍵詞：茯苓多糖；B16黑色素瘤小鼠；肺轉(zhuǎn)移；白細胞

惡性腫瘤是一類嚴重危害人類身體健康的疾病，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤復發(fā)以及導致患者死亡的重要原因，約90%的腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，50%以上惡性腫瘤患者于初次診斷時已發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移[1]。因此防治腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是降低腫瘤患者病死率的重要途徑之一。腫瘤常見的轉(zhuǎn)移途徑有3種：1）淋巴道轉(zhuǎn)移，2）血道轉(zhuǎn)移，3）種植轉(zhuǎn)移。

近年來有研究表明，固有免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中扮演相當重要的角色。崔正等[2-4]報道，腫瘤自然消退/完全消退（SR/CR）小鼠的粒細胞能夠抵抗多種類型的癌細胞，可使腫瘤產(chǎn)生自發(fā)性消退，其中性粒細胞體外能在腫瘤細胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，通過“發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞→識別瘤細胞表面特征并包圍瘤細胞→釋放抗瘤物質(zhì)”殺死瘤細胞。移植SR/CR小鼠粒細胞至普通小鼠，普通小鼠可獲得抗腫瘤能力。如果在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，中性粒細胞能在腫瘤細胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，并殺死瘤細胞，則可能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)代藥理學研究表明茯苓具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗細胞黏附與轉(zhuǎn)移及機體免疫調(diào)節(jié)的作用。在前期實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠促進體外培養(yǎng)的大鼠中性粒細胞在肝癌細胞周圍形成玫瑰化環(huán)樣結(jié)構(gòu)，并且與增加白細胞CD11b和CD18mRNA表達相關(guān)。

因此本實驗擬通過考察茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移的影響，并檢測外周血白細胞數(shù)量及脾質(zhì)量、脾指數(shù)，以期明確茯苓多糖是否具有抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 茯苓多糖提取物粉末：由天津中醫(yī)藥大學趙駿老師提供。順鉑注射液：云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司。

C57BL/6荷B16黑色素瘤小鼠40只，4周齡，雌雄各半，尾靜脈注射接種黑色素瘤細胞2×105個/只，購自北京力科愛達生物技術(shù)咨詢服務(wù)中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和給藥方法 將40只已接種B16黑色素瘤的小鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組10只，即模型組、順鉑注射液組、茯苓多糖低劑量組、茯苓多糖高劑量組。

接種瘤細胞后第2天開始尾靜脈注射給藥，茯苓多糖高劑量組給予每只小鼠茯苓多糖0.5 mg，茯苓多糖低劑量組給予每只小鼠茯苓多糖苓多糖0.33 mg，順鉑組給予順鉑0.04 mg，模型組給予生理鹽水，所有藥物均于給藥當天用生理鹽水新鮮配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，每只0.2 mL，隔天給藥1次。

1.2.2 一般情況觀察 定期觀察動物精神狀態(tài)、進食和排便情況。

1.2.3 對小鼠體質(zhì)量的影響 第1次給藥前電子天平稱量小鼠體質(zhì)量，此后隔天稱質(zhì)量，并繪制體質(zhì)量變化曲線。

1.2.4 外周血白細胞數(shù)量 接種腫瘤后第21天，小鼠稱質(zhì)量，眼內(nèi)眥取血，加入白細胞稀釋液計數(shù)白細胞數(shù)量。

1.2.5 肺轉(zhuǎn)移灶個數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率 接種腫瘤后第21天，取血后處死小鼠，取出肺臟，經(jīng)生理鹽水漂洗后計數(shù)小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)。轉(zhuǎn)移灶計算方法：轉(zhuǎn)移灶呈黑色小結(jié)節(jié)狀。據(jù)肺結(jié)節(jié)直徑將其分為4級：Ⅰ級＜0.5 mm，0.5 mm≤Ⅱ級≤l mm，1 mm≤Ⅲ級≤2 mm，Ⅳ級≥2 mm[5]，肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)＝Ⅰ級轉(zhuǎn)移灶個數(shù)×1+Ⅱ級轉(zhuǎn)移灶個數(shù)×2+Ⅲ級轉(zhuǎn)移灶個數(shù)×3+Ⅳ級轉(zhuǎn)移灶個數(shù)×4。計數(shù)完畢后將肺組織放入4%多聚甲醛固定，以備后續(xù)實驗使用。

肺轉(zhuǎn)移抑制率（%）＝（模型組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)-治療組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)）/模型組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)×100%。

1.2.6 脾質(zhì)量及脾指數(shù) 接種腫瘤后第21天，取血后處死小鼠，取出脾臟，稱取脾質(zhì)量，并計算脾指數(shù)。計算公式：脾指數(shù)＝脾質(zhì)量/（體質(zhì)量-瘤質(zhì)量）× 100%。

1.2.7 病理組織學檢測 將小鼠肺組織放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木-伊紅染色，每個樣本隨機選取5個視野，10×物鏡下計數(shù)微小轉(zhuǎn)移灶個數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.5統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。正態(tài)分布計量資料的組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），偏態(tài)分布計量資料的組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察 B16黑色素瘤人工肺癌轉(zhuǎn)移模型小鼠給藥后，順鉑組小鼠表現(xiàn)自主活動減少、倦怠，茯苓多糖高、低劑量組小鼠精神狀態(tài)良好，毛色光滑，未見明顯異常。

2.2 茯苓多糖對B16黑色素瘤荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響 由圖1可以看出，與模型組比較，茯苓多糖高、低劑量組對B16荷瘤鼠的體質(zhì)量無明顯影響，順鉑組小鼠體質(zhì)量明顯減輕。

圖1 茯苓多糖對B16黑色素瘤荷瘤鼠體質(zhì)量變化的影響Fig.1 The body weight of mice after melanoma B16 cells injection

2.3 茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)的影響 各組小鼠均出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，順鉑、茯苓多糖高劑量可明顯降低肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，茯苓多糖低劑量組肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)與模型組無統(tǒng)計學差異，順鉑組、茯苓多糖高劑量和低劑量組對肺轉(zhuǎn)移的抑制率分別為45.8%、38.8%、23.4%。順鉑組和茯苓多糖高劑量組小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)與模型組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。見表1。

表1 茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)的影響Tab.1 Effects of pachymaran on lung metastasis in B16 melanoma mice

2.4 茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型肺微小轉(zhuǎn)移灶的影響 HE染色觀察計數(shù)微小轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，結(jié)果表明，用藥各組與模型組比較均可以顯著減少B16黑色素瘤荷瘤鼠肺部微小轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量（P＜0.05），與順鉑組比較，茯苓多糖高劑量組無統(tǒng)計學差異。見表2。

2.5 茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺癌轉(zhuǎn)移模型小鼠外周血白細胞數(shù)的影響 與模型組比較，茯苓多糖高劑量組與順鉑組外周血白細胞數(shù)量明顯降低，茯苓多糖低劑量組與模型組無統(tǒng)計學差異。與順鉑組比較，茯苓多糖低劑量和高劑量組外周血白細胞數(shù)量均明顯增加（P＜0.05）。見表3。

表2 茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺微小轉(zhuǎn)移灶的影響（x±s）Tab.2 Effects of pachymaran on lung micrometastases in B16 melanoma mice（x±s） 個

表3 茯苓多糖對B16黑色素瘤荷瘤鼠外周血白細胞數(shù)的影響（x±s）Tab.3 Effects of pachymaran on the count of the peripheral blood leukocyte in B16 melanoma mice（x±s）

2.6 茯苓多糖對B16黑色素瘤人工肺癌轉(zhuǎn)移模型小鼠脾質(zhì)量和脾指數(shù)的影響 與模型組比較，順鉑組明顯降低B16荷瘤鼠脾質(zhì)量和脾指數(shù)，茯苓多糖低劑量組可以增加B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)（P＜0.05），茯苓多糖高劑量對B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)無明顯影響，茯苓多糖高、低劑量組脾指數(shù)無統(tǒng)計學差異。與順鉑組比較，茯苓多糖高、低劑量組均能增加B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)（P＜0.05）。見表4。

表4 茯苓多糖對B16黑色素瘤荷瘤鼠脾臟指數(shù)的影響（x±s）Tab.4 Effects of pachymaran on spleen index in B16 melanoma mice（x±s）

3 討論

B16黑色素瘤是1954年發(fā)現(xiàn)的，該瘤是自發(fā)于純系鼠C57BL/6耳根皮膚的色素瘤，B16黑色索瘤的肺轉(zhuǎn)移率大于90%。尾部靜脈注射會迫使腫瘤細胞集中于肺部毛細血管，可以用來研究腫瘤細胞肺部溢出和定居功能[6]，Hart[7]給C57BL/6小鼠從尾靜脈注入B16黑色素瘤細胞后3周殺鼠檢查轉(zhuǎn)移灶，同時用同位素標記腫瘤細胞，并定時測各器官放射強度，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞只定位于肺。

腫瘤的侵襲及血行轉(zhuǎn)移是一個復雜、多步驟的過程，大致過程為原發(fā)腫瘤細胞自律性增殖后，從原發(fā)腫瘤灶脫離，降解基底膜，向外浸潤、遷移進而進入循環(huán)系統(tǒng)隨著血流到達并停留于遠處的血管壁穿過血管，侵入細胞外基質(zhì)，最后在特定的組織或器官形成轉(zhuǎn)移灶。

順鉑是臨床上常用的化療藥物之一，進入腫瘤細胞后與DNA交叉聯(lián)合抑制其復制，并損傷細胞膜結(jié)構(gòu)，有較強的廣譜抗腫瘤作用，其療效確切，但不良反應大。賈英杰等[8]單純應用中藥治療中晚期惡性腫瘤患者，能夠提高患者卡氏評分、改善患者臨床癥狀、總體功能，顯著提高患者的生活質(zhì)量。臨床常用中草藥經(jīng)現(xiàn)代藥理及臨床研究發(fā)現(xiàn)，黨參、黃芪、白術(shù)、山藥、茯苓等益氣健脾藥物具有調(diào)節(jié)腫瘤患者免疫功能的作用，以增強免疫監(jiān)視能力為特征，能提高T淋巴細胞功能，提高自然殺傷細胞細胞的活性，從而可提高機體識別異己、殺滅變異、抑制腫瘤的能力[9]。茯苓多糖是茯苓的主要成分，硫酸化茯苓多糖可以通過增強NK細胞殺傷活力、促進淋巴細胞增殖、增強機體特異性免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，還可以拮抗免疫抑制藥所致的免疫抑制[10]。

本實驗采用尾靜脈注射B16黑色素瘤復制人工肺轉(zhuǎn)移模型，以順鉑作對照，檢測茯苓多糖對荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移、外周血白細胞數(shù)量及脾質(zhì)量、脾指數(shù)的影響，以期明確茯苓多糖是否具有抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用并探討其作用機制。

實驗結(jié)果表明，順鉑雖然能夠抑制肺轉(zhuǎn)移，但同時有降低小鼠體質(zhì)量、外周血白細胞數(shù)量及脾質(zhì)量和脾指數(shù)等不良反應。而茯苓多糖高、低劑量組對B16荷瘤鼠的體質(zhì)量無明顯影響，茯苓多糖高劑量可明顯降低肺表面轉(zhuǎn)移灶個數(shù)及肺微小轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，茯苓多糖低劑量可減少肺微小轉(zhuǎn)移灶個數(shù)，說明茯苓多糖高劑量組外周血白細胞數(shù)量明顯降低，茯苓多糖低劑量組外周血白細胞數(shù)量與模型組能夠抑制肺轉(zhuǎn)移。茯苓多糖高劑量組外周血白細胞數(shù)量明顯降低，茯苓多糖低劑量組外周血白細胞數(shù)量與模型組無統(tǒng)計學差異，說明茯苓多糖對外周血白細胞數(shù)無明顯升高作用。茯苓多糖低劑量組可以增加B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)，茯苓多糖高劑量對B16荷瘤鼠的脾質(zhì)量和脾指數(shù)無明顯影響。茯苓多糖高、低劑量組脾質(zhì)量和脾指數(shù)均高于順鉑組，說明茯苓多糖無明顯免疫抑制作用，茯苓多糖高、低劑量組精神狀態(tài)優(yōu)于順鉑組，皮毛顏色較順鉑組光滑黑亮，說明茯苓多糖可提高小鼠生活質(zhì)量。

綜上所述，茯苓多糖能夠抑制尾靜脈注射B16荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移，增加其脾質(zhì)量和脾指數(shù)，無明顯增加其外周血白細胞數(shù)量的作用?；诠P者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠增加體外培養(yǎng)的大鼠中性粒細胞在肝腫瘤細胞周圍形成玫瑰化環(huán)樣結(jié)構(gòu)，并且與增加白細胞CD11b和CD18mRNA表達相關(guān)，推測活化外周血白細胞可能是茯苓多糖抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制之一。

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（本文編輯：高 杉，于春泉）

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1672-1519（2014）02-0098-04

收稿日期：（2013-11-14）

*基金項目：天津市應用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃重點項目（10JCZDJC21300）。

作者簡介：張密霞（1975-），女，碩士，實驗師，研究方向為中藥藥理。

通訊作者：張艷軍，E-mail：zyjsunye@163.com。

Effects of pachymaran on hematogeneous lung metastasis in mice with melanoma B16

ZHANG Mi-xia,ZHANG De-sheng,ZHUANG Peng-wei,ZHANG Yan-jun
（Tianjin University of TCM,Tianjin 300193，China）

Abstract:[Objective]To investigate the effects and mechanism of pachymaran on lung metastasis in mice with melanoma B16.[Methods]C57BL/6 mice were injected with melanoma B16 cells through tail vein.After establishment of the model,mice were divided into 4 groups with ten mice each.The drug was given through the tail vein every two days in pachymaran high-dose group(pachymaran,0.5 mg every mouse),pachymaran low-dose group (pachymaran,0.33 mg every mouse),cisplatin group (cisplatin,0.04 mg every mouse),and control group (normal saline).The number of metastasis on the surface of the lung was calculated 21 days later.The number of micrometastases in lung was determined by HE staining.We also detected the count of peripheral blood leukocytes and spleen weight, spleen index at the 21st day.[Results]Cisplatin could suppress lung metastases,while reduce the body weight of mice,peripheral blood leukocyte counts,and spleen weight and spleen index.Pachymaran low-dose and high-dose groups had no effect on the body weight of B16 tumor-bearing mice.Pachymaran high-dose group could reduce the number of lung surface metastases.Pachymaran low-dose and high-dose groups could reduce the number of lung micrometastases.Pachymaran high-dose group could significantly decrease the number of the peripheral blood leukocyte but pachymaran low-dose group had no significant effect to it.Pachymaran low-dose group can increase the spleen weight and spleen index of B16 tumor-bearing mice,but low-dose group had no significant effect on them.The spleen weight and spleen index in the Pachymaran low-dose and high-dose groups were higher than the cisplatin group.[Conclusion]Pachymaran can inhibit lung metastases of B16 tumor bearing mice,increase the spleen weight and the spleen index.At the same time,it does not increase the number of the peripheral blood leukocyte.So we speculated that the activation of peripheral blood leukocytes and enhancement of immune function may be involved in the mechanism of the suppression of tumor metastasis of pachymaran.

Key words：pachymaran;B16 melanoma mice;lung metastasis;leukocyte