王 平，楊 光，吳純標(biāo)，王為民，趙雪圓，張君濤，張 超

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，天津 300193）

·實(shí)驗(yàn)研究·

榮筋片影響SAMP6鼠血清成骨-成脂分化調(diào)控因子的實(shí)驗(yàn)研究*

王 平，楊 光，吳純標(biāo)，王為民，趙雪圓，張君濤，張 超

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，天津 300193）

摘要：[目的]以SAMP6及SAMR1鼠為研究對象，觀察榮筋片對骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、過氧化酶活化增生受體-γ（PPAR-γ）和脂聯(lián)素（ADP）血清含量的影響，探討榮筋片防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。[方法]選取6月齡SAMP6鼠36只，雌雄各半，隨機(jī)分為SAMP6空白對照組、榮筋片組、仙靈骨葆組。另取11只同月齡性SAMR1鼠，作為同源對，將榮筋片配制成溶液?？瞻讓φ战M給予0.5 mL生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周后。摘眼球采血，ELISA法檢測血清BMP-2、PPAR-γ和ADP的含量。[結(jié)果]空白對照組BMP-2血清含量明顯低于SAMRl對照組、仙靈骨葆和榮筋片組（P＜0.01，P＜0.05），差異有顯著性。SAMRl對照組相比BMP-2血清含量高于仙靈骨葆組和榮筋片組（P＜0.01，P＜0.05）。而榮筋片組高于仙靈骨葆組（P＜0.05）?？瞻讓φ战MPPAR-γ血清含量明顯高于SAMRl對照組（P＜0.01）。仙靈骨葆組、榮筋片組和空白對照組組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。ADP血清含量空白對照組明顯高于SAMRl對照組（P＜0.01）。仙靈骨葆組和榮筋片組明顯低于空白對照組（P＜0.01），相比SAMRl對照組明顯升高（P＜0.01）。[結(jié)論]榮筋片與仙靈骨葆能增加SAMP6鼠血清促成骨分化因子BMP-2含量，降低SAMP6鼠血清促成脂分化因子PPAR-γ、ADP含量。兩種中藥可能改善自發(fā)性骨質(zhì)疏松動物骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨-成脂分化的異常。

關(guān)鍵詞：榮筋片；骨質(zhì)疏松癥；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；成骨-成脂分化

骨質(zhì)疏松癥（OP）是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。近年研究表明衰老和病理因素造成的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMCS）成骨-成脂分化異常，是骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病因素[2]。中醫(yī)學(xué)“腎主骨生髓”理論與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）增殖分化的相關(guān)性，為中醫(yī)學(xué)腎本質(zhì)及補(bǔ)腎中藥研究提供了新思路[3]。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，利用快速骨老化小鼠（SAMP6）這一增齡性骨質(zhì)疏松動物模型，觀察補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方榮筋片對其血清成骨-成脂關(guān)鍵調(diào)控因子的影響，進(jìn)行了本研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 榮筋片：甘草、牛膝、白蒺藜、陳皮、杜仲、茯苓等。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號：津藥制字（2001）Z第0195號，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥廠提供。仙靈骨葆膠囊：淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂等。由貴州同濟(jì)堂制藥公司提供，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20025337。TRIZOL試劑（invitrogen），淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶），氯仿（BBI），異丙醇（BBI），無水乙醇（BBI），DEPC H2O（BBI），BMP-2試劑盒（博士德），PPARγ2試劑盒（SantaCruz），ADP試劑盒（SantaCruz）。

1.1.2 主要儀器 電子天平（瑞士METTER AE100型），移液器（德國EPPENDORF），干燥箱（日本三洋MIR-153型），低溫冰箱（日本三洋MDF-382E型），恒溫水浴箱（江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型），超低溫冰箱（Model 925,Forma Scientific Inc，美國），臺式冷凍離心機(jī)（Universal 16R,Hettich Zentrifugen，德國）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物與分組 選取健康齡6月齡SAMP6鼠36只,雌雄各半，按隨機(jī)分為榮筋片組、仙靈骨葆組、空白對照組，另取11只同月齡抗快速老化小鼠（SAMR1），作為同源對照組。所取動物均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)動物都飼養(yǎng)在恒溫（24±2）℃、濕度（55±5）%，12 h/ 12 h循環(huán)光照的條件下，自由進(jìn)食飲水，每籠5只小鼠，每周更換鼠籠1次，以排除飲食及環(huán)境等所有可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素。

1.2 方法

1.2.1 灌胃方案 據(jù)文獻(xiàn)[4]，人與小鼠用藥劑量的折算系數(shù)W＝9.01，按（g/kg）＝W×人常用量（g/kg）計(jì)算出小鼠的用藥劑量。將榮筋片按換算劑量配制成溶液，每次給藥0.5 mL，給藥前將小鼠禁食6 h，使其處于空腹?fàn)顟B(tài)，便于藥物的吸收?？瞻讓φ战M給予0.5 mL生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。

1.2.2 血清的制備 在末次灌胃1 h后固定小鼠，摘眼球采血，不加抗凝劑。室溫下靜置2 h后待血塊自然凝固收縮后，1 500 r/min離心15 min，分離上層血清，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測定血清中成骨-成脂分化關(guān)鍵調(diào)控因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、過氧化酶活化增生受體-γ（PPAR-γ）和脂聯(lián)素（ADP）的含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析用（one-wayANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清BMP-2結(jié)果的比較 各組血清BMP-2的含量見表1，空白對照組BMP-2血清含量明顯低于SAMRl對照組、仙靈骨葆組和榮筋片組（P＜0.01，P＜0.05），有顯著差異。SAMRl對照組相比BMP-2血清含量高于仙靈骨葆組和榮筋片組（P＜0.01，P＜0.05），而榮筋片組高于仙靈骨葆組（P＜0.05）。

表1 各組血清BMP-2含量（x±s）Tab.1 The BMP-2 contents of serum in each group（x±s）pg/mL

2.2 各組血清PPAR-γ結(jié)果的比較 各組血清PPAR-γ的含量見表2，空白對照組PPAR-γ血清含量明顯高于SAMRl對照組（P＜0.01）。仙靈骨葆組、榮筋片組和空白對照組組間沒有明顯差異（P＞0.05）。

2.3 各組血清ADP的結(jié)果比較 各組血清ADP的含量見表3，空白對照組ADP血清含量明顯高于SAMRl對照組（P＜0.01），有顯著差異。仙靈骨葆組和榮筋片組ADP血清含量明顯低于空白對照組（P＜0.01），相比SAMRl對照組明顯升高（P＜0.01），有顯著差異。榮筋片組和仙靈骨葆組組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組血清PPAR-γ含量（x±s）Tab.2 The PPAR-γ contents of serum in each group（x±s）ng/mL

表3 各組ADP血清含量（x±s）Tab.3 The ADP contents of serum in each group（x±s）pg/mL

3 討論

OP隸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”范疇[5-6]，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精，主骨生髓，腎精足則筋骨強(qiáng)健有力，榮筋片為津門已故名老中醫(yī)葉希賢創(chuàng)立，臨床用于治療OP有較好的效果，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨，健脾益氣之功效。骨組織脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞均來源于BMCS，成骨與成脂分化為“倒數(shù)”關(guān)系[7]，BMCS分化方向改變可能是OP的原因之一。SAMP6鼠較好地體現(xiàn)了增齡性O(shè)P的病理變化，是研究OP發(fā)病機(jī)理及開發(fā)有效治療手段的理想模型[8-9]，伴隨骨質(zhì)疏松的發(fā)生，SAMP6鼠BMCS成脂分化明顯增強(qiáng)，成骨分化減弱[10-11]。

BMP-2是骨組織形成過程中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，各組SAMP6鼠BMP-2血清含量均低于SAMRl鼠，說明SAMP6鼠的BMCS成骨分化能力減弱，可能與其自發(fā)性骨質(zhì)疏松有關(guān)，而榮筋片組BMP-2血清含量明顯高于空白對照組，說明榮筋片能夠促進(jìn)SAMP6鼠BMCS成骨方向分化。PPAR-γ介導(dǎo)MSCs成脂分化可直接影響成骨細(xì)胞的分化，在某種程度上在MSCs成骨與成脂的分化進(jìn)程中可能起到“分子開關(guān)”的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)SAMP6鼠的PPAR-γ血清含量明顯高于SAMRl鼠，說明SAMP6鼠BMCS成脂分化增強(qiáng)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[10-11]，而榮筋片、仙靈骨葆對PPAR-γ血清含量未顯示出明顯影響。另一種重要的成脂分化因子ADP，參與糖、脂代謝[14]，可同時(shí)影響骨形成和骨吸收[15]，本研究中SAMP6鼠的ADP血清含量明顯高于SAMRl小鼠，亦說明SAMP6鼠BMCS成脂分化增強(qiáng)，而榮筋片組明顯低于空白對照組，說明榮筋片某種程度上能夠抑制BMCS向成脂細(xì)胞分化。

MSCs成骨-成脂分化的方向主要是由骨髓局部微環(huán)境多種因素決定，榮筋片和仙靈骨葆膠囊兩種中藥均可增加SAMP6鼠血清促成骨分化因子BMP-2含量，降低SAMP6鼠血清促成脂分化因子PPAR-γ、ADP含量，推測二者均能改善自發(fā)性骨質(zhì)疏松動物BMCS成骨-成脂分化的異常，而骨髓局部微環(huán)境成骨-成脂分化的影響及其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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（本文編輯：馬 英，高 杉）

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-1519（2014）02-0088-03

收稿日期：（2012-12-30）

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30801475）。

作者簡介：王 平（1964-），男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事慢性脊柱退變疾病及疼痛癥的中西醫(yī)診治研究。

通訊作者：楊 光，E-mail:yanyangsky@163.com。

The effection on adipogenesis-osteogenesis differentiation factors of SAMP6 mice serum by Rong Jinpian

WANG Ping,YANG Guang,WU Chun-biao,WANG Wei-min,ZHAO Xue-yuan,ZHANG Jun-tao,ZHANG Chao
（Department of orthopedics and traumatology,the First Afflilated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

Abstract:[Objective]Use senescence-accelerated mouse prone 6(SAMP6)mice and senescence accelerated mouse re-istant1(SAMR1) mice as the research object,observe the effection of Rong Jinpian on BMP-2,PPAR-γ and ADP in serum.[Methods]Choose 36 six months SAMP6 mices,male and female half,according to randomized SAMP6 blank control group,Rong jinpian group,Xianling Gubao group.Another 11 months with resistance to rapid aging SAMR1 mice,as homologous comparison control group,the Rong Jinpian mixture solution according to the dose conversion.Blank control group to give 0.5 mL saline lavage,1 times a day,12 consecutive weeks.ELISA method to detect serum BMP-2,PPAR-γ and ADP levels was used.[Results]Serum BMP-2 of blank control group was significantly lower than the other three groups(P＜0.01,P＜0.05).The SAMRl group was higher than the Xianling Gubao and Rong Jinpian group(P＜0.01, P＜0.05).Serum PPAR-γ level of blank control group was significantly higher than the other three groups(P＜0.01,P＜0.05).Compared with that blank control group,Rong Jinpian and Xianling Gubao group on ADP significantly lower.[Conclusion]Compared with SAMP1 group,SAMP6 mice had lower BMP-2 level,higher PPAR-γ and ADP level in serum because spontaneous osteoporosis.Rong Jinpian and Xianling Gubao could raise BMP-2 level,dcrease PPAR-γ and ADP level in serum of SAMP6 mice.

Key words:Rong Jinpian;osteoporosis;marrow stromal cell;differentiation of adipogenesis and osteogenesis