寧博林，徐 澤，李 悅，韓興龍，汪志軍，王秋實(shí)，李井春

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

隨著胚胎生物工程技術(shù)的發(fā)展，如動物體外受精、克隆、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，都面臨胚胎體外囊胚發(fā)育率低和質(zhì)量差的問題［1，2］，其關(guān)系到整個(gè)胚胎工程產(chǎn)業(yè)的成敗。然而，早期胚胎體外培養(yǎng)大多數(shù)研究主要集中在胚胎發(fā)育所需要的培養(yǎng)液上，卻忽略了早期胚胎在體內(nèi)輸卵管中發(fā)育所需要的物理性因素，即發(fā)育的微環(huán)境及機(jī)械性力刺激的影響。早期胚胎在輸卵管中既需要胚胎生長發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)，也同時(shí)受到輸卵管蠕動時(shí)的擠壓力、輸卵管液流動的層流剪切力以及與上皮纖毛接觸的摩擦力等的作用。如何在體外模擬輸卵管對早期胚胎發(fā)育的物理性刺激的微環(huán)境成為問題的關(guān)鍵。這樣就想到了微流控芯片技術(shù)，其是20 世紀(jì)90年代初，基于微電子、微機(jī)械、生物工程和納米技術(shù)發(fā)展起來的一種新的研究技術(shù)［3，4］。

Akagi 等［5］利用PDMS 制作顯微小室的顯微培養(yǎng)盤，利用其培養(yǎng)早期胚胎時(shí)，囊胚發(fā)育率和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)明顯高于常規(guī)的液滴培養(yǎng)法。最近，日本研究者使用振搖胚胎培養(yǎng)刺激裝置對小鼠和人的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，取得良好的培養(yǎng)效果。推測可能是通過振搖物理刺激有利于胚胎自身分泌的促進(jìn)胚胎發(fā)育因子在胚胎間擴(kuò)散及相互作用，同時(shí)也有利于胚胎代謝產(chǎn)物排出［6］。Chae Yun Bae等［7］應(yīng)用微流控培養(yǎng)裝置對牛的胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)施加不同大小機(jī)械力的刺激，在適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力刺激下能夠明顯增加囊胚發(fā)育率。目前，在國內(nèi)應(yīng)用微流控芯片模擬輸卵管進(jìn)行早期胚胎的研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微流控芯片技術(shù)模擬早期胚胎體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境制作了胚胎體外培養(yǎng)微流控芯片裝置并施加適當(dāng)?shù)奈锢硇源碳ぃ骄颗咛ンw外培養(yǎng)微流控芯片對小鼠早期胚胎體外發(fā)育率及質(zhì)量的影響，為早期胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)改良提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

昆明系小白鼠(雄性12 ～16 周齡，雌性6 ～8 周齡) 來自于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院動物繁殖教研室，自繁，自由飲水，自由采食，12 ～14 h 光照，室溫20 ～26 ℃。

1.2 主要試劑與儀器

試劑有m CZB 液(自制) 見表1、孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波激素廠) 、人絨毛膜促性腺激素(HCG，寧波激素廠) 、谷胱甘肽、道康寧-184 預(yù)聚體和凝固劑(美國產(chǎn)，PDMS) 等; 儀器包括二氧化碳培養(yǎng)箱、真空脫泡器、實(shí)體顯微鏡、干燥箱等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微流控芯片培養(yǎng)盤的制備

一次性鑄模構(gòu)建微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置，預(yù)先設(shè)計(jì)并制作模具，將PDMS 預(yù)聚體和凝固劑混合好(v/v 為10 ∶1) ，脫泡處理后，澆鑄在模具中，放入干燥箱中升溫到75 ℃，30 min，處理后將模具拆下，這樣微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置就制備完成，備用(制作過程見圖1) 。

圖1 一次性成型的微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置示意圖與實(shí)物圖

1.3.2 微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置系統(tǒng)的構(gòu)成

主要由微流控芯片培養(yǎng)盤、微流控芯片培養(yǎng)裝置振動系統(tǒng)等組成，具體見圖2。

圖2 胚胎體外培養(yǎng)微流控芯片裝置示意圖

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 微流控芯片培養(yǎng)裝置對小鼠早期胚胎體外發(fā)育率的影響

將小鼠的受精卵隨機(jī)分成三組，分別為: 對照組1 為常規(guī)液滴培養(yǎng)組(CZB 培養(yǎng)液) 、對照組2 為CZB +谷胱甘肽微滴培養(yǎng)組、微流控芯片培養(yǎng)組。CZB +谷胱甘肽組為在CZB 培養(yǎng)液中添加5 mmol/L 的谷胱甘肽; 微流控芯片培養(yǎng)組培養(yǎng)液為在CZB 培養(yǎng)液中添加5 mmol/L 的谷胱甘肽并且在微流芯片中進(jìn)行培養(yǎng)。將三組的結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.4.2 微流控芯片培養(yǎng)裝置對小鼠早期囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

將對照組和微流控芯片組培養(yǎng)得到的囊胚經(jīng)過H33342 染色后，利用熒光顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞數(shù)。比較兩組的差異性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用StatView 5.0 軟件對實(shí)驗(yàn)測定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。當(dāng)P ＜0.05 時(shí)差異顯著，肩標(biāo)字母不同表示差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 微流控芯片培養(yǎng)裝置對小鼠早期胚胎體外發(fā)育率的影響

由表1 可知，對照組1 與對照組2 中2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率、囊胚發(fā)育率都差異顯著(P ＜0.05) 。對照組1 與微流芯片組中2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率、囊胚發(fā)育率都差異顯著(P ＜0.05) 。對照組2 與微流控芯片組中2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率差異不顯著(P ＞0.05) ，但是，在8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率都差異顯著(P ＜0.05) 。

表1 微流控芯片培養(yǎng)裝置對小鼠早期胚胎體外發(fā)育率的影響

2.2 微流控芯片培養(yǎng)裝置對小鼠早期囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

從表2 可以看出，微流控芯片組與液滴培養(yǎng)組在囊胚總細(xì)胞數(shù)存在顯著差異(P ＜0.05) 。

表2 微流控芯片培養(yǎng)裝置對小鼠早期囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

3 分析與討論

我們采用的一次性鑄型微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置制備方法與常規(guī)的制作方法進(jìn)行比較，操作簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，也不會出現(xiàn)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液滲漏的現(xiàn)象。

微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置對小鼠早期胚胎體外發(fā)育率影響的結(jié)果見表1。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果上可以看出，谷胱甘肽添加到培養(yǎng)液中可以在一定程度上克服小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯的問題，所以液滴培養(yǎng)法，在添加谷胱甘肽時(shí)，與沒有添加谷胱甘肽組相比，卵裂率上存在顯著差異，這也說明添加谷胱甘肽可以作為一種有效的抗氧化劑克服小鼠早期胚胎發(fā)育的阻滯問題。本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果與方南洙［8］等發(fā)表的結(jié)果一致。所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微流控芯片培養(yǎng)裝置進(jìn)行小鼠早期培養(yǎng)時(shí)，所用的培養(yǎng)液中也添加谷胱甘肽。

有學(xué)者報(bào)道，多個(gè)胚胎在少量的培養(yǎng)液中同時(shí)培養(yǎng)有利于胚胎發(fā)育，增加囊胚總細(xì)胞數(shù)目，促進(jìn)胚胎移植后的存活。主要是因?yàn)檫@些胚胎產(chǎn)生了有益的促生長因子，從而刺激其自身和周圍胚胎的發(fā)育。當(dāng)在少量的培養(yǎng)液中增加胚胎的數(shù)量時(shí)會使促進(jìn)生長因子的濃度增加，作用更強(qiáng)［9］。當(dāng)然，過多的胚胎在太少量的培養(yǎng)液中培養(yǎng)也是有害的，會產(chǎn)生更多的氨和氧自由基物質(zhì)，最佳的范圍應(yīng)該是每個(gè)胚胎0.5 ～2 μL［10，11］。而一個(gè)動態(tài)的微觀培養(yǎng)體系可以及時(shí)地將有害物質(zhì)排出去。微流控芯片胚胎體外培養(yǎng)裝置可以滿足早期胚胎體外發(fā)育的微環(huán)境的要求。由表1 還可觀察出，CZB +谷胱甘肽組和微流芯組在2 細(xì)胞期前胚胎發(fā)育率差異不顯著，但從8-細(xì)胞期開始微流芯片組胚胎發(fā)育率較高。分析原因應(yīng)該是微流芯片組施加了適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激，促進(jìn)了胚胎的發(fā)育。從表2可以看出，微流控芯片組顯著提高小鼠囊胚總細(xì)胞數(shù)，這可能是利用微流控芯片培養(yǎng)裝置進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)過程中施加一定的物理性刺激有利于胚胎細(xì)胞的分裂和生長。同時(shí)，也促進(jìn)各胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的有益生長因子的擴(kuò)散，彼此之間促進(jìn)生長。

通過實(shí)驗(yàn)可知，利用PDMS 生物相容性好、透明度高、無毒性的材料制作胚胎體外培養(yǎng)裝置模擬輸卵管結(jié)構(gòu)，微流控芯片胚胎體外培養(yǎng)裝置可以滿足小鼠早期胚胎體外發(fā)育的微環(huán)境的要求，也能對胚胎施加適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性刺激，在體外模擬輸卵管是可行的。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中PDMS 一次鑄造成型芯片操作簡單，且不易出現(xiàn)培養(yǎng)液外漏的現(xiàn)象。所以PDMS 一次性鑄造成型的微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置是可行的。應(yīng)用一次性鑄型的微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置進(jìn)行小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)，顯著提高了小鼠體外囊胚發(fā)育率。

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