趙樹平，包維臣，高鵬飛，，姚國強，，郭 霄，張和平

（1.內(nèi)蒙古和美科盛生物技術(shù)有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

19世紀初，凝結(jié)芽孢桿菌因?qū)е聼捜槌霈F(xiàn)大規(guī)模的凝結(jié)現(xiàn)象及番茄、土豆等制品的酸敗變質(zhì)被深入的研究，而于1932年被首次分離并對其進行了詳細描述［1－3］。發(fā)展至今，諸多研究表明凝結(jié)芽孢桿菌作為一種獨特的新型芽孢益生菌，其既具有乳酸菌的產(chǎn)乳酸特性，又具有芽孢桿菌的豐富的酶系統(tǒng)及抗逆性強、耐高溫高壓、穩(wěn)定的儲存特性。作為益生菌家族的后起之秀，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健、畜牧和水產(chǎn)等行業(yè)，并能產(chǎn)生多種健康的影響：調(diào)整腸道微生態(tài)平衡、提高機體免疫、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)及促進動物生長，成為益生菌中研究的熱點。本文對國內(nèi)外關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌特性、益生作用、益生機理及在動物中的應(yīng)用總結(jié)和概括。

1 凝結(jié)芽孢桿菌

1.1 凝結(jié)芽孢桿菌的一般特性

隨著對凝結(jié)芽孢桿菌研究的不斷深入，其特性也逐漸被人熟知。此菌為革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，營養(yǎng)細胞呈桿狀，具有一定的運動性，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，甘露醇，棉子糖，海藻糖產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，可水解淀粉及酪蛋白。此菌為過氧化氫酶陽性，缺乏細胞色素C 氧化酶及將硝酸鹽降解為亞硝酸鹽的能力。菌落形態(tài)為不透明白色，呈圓形，表面突出。其芽孢體端生，呈橢圓形。凝結(jié)芽孢桿菌在有氧和無氧環(huán)境中均可生長，但乳酸的產(chǎn)生量在有氧條件下明顯低于無氧條件，而生物量卻恰恰與此相反，這說明環(huán)境中氧氣含量可改變該菌的某些代謝途徑。葡萄糖發(fā)酵主要產(chǎn)物為L（＋）－乳酸，屬同型乳酸發(fā)酵，除此之外，還可生成少量的乙酰甲基甲醇、乙酸及乙醇等。凝結(jié)芽孢桿菌在30～55℃條件下均可生長，其中最適合生長溫度為37～45℃，最適生長pH 為6.6～7.0，液體培養(yǎng)前期最低發(fā)酵pH 在4.0～5.0之間，但在pH 為1.5的條件下，仍可生長良好，在發(fā)酵后期會出現(xiàn)反升現(xiàn)象pH可達到7.0～8.0。

在凝結(jié)芽孢桿菌的生長過程中，某些物質(zhì)對菌體的生長起到了比較顯著的促進效果。其中，菌體生長所需的主要生長因子包括：生物素、硫胺素（維生素B1）、谷氨酸、天門冬氨酸、半胱氨酸、煙酸、組氨酸、核黃素、葉酸、甲硫氨酸、腺嘌呤、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、精氨酸、絲氨酸、亮氨酸、纈氨酸［4］。但不同菌株和不同溫度條件下所需生長因子種類也存在差異。值得關(guān)注的是，生物素和硫胺素是凝結(jié)芽孢桿菌在不同溫度條件下均需要的生長因子，說明這兩種物質(zhì)可能無法通過該菌自身合成或合成量無法滿足生長需求，但同時也預(yù)示了此物質(zhì)可能參與了凝結(jié)芽孢桿菌的某些重要代謝途徑。

與普通乳酸菌相比，凝結(jié)芽孢桿菌具有良好的抗逆性。其芽孢體對高溫及低pH 環(huán)境具有很強的耐受性，因此可順利通過胃腸道，并起到顯著的益生效果。

1.2 凝結(jié)芽孢桿菌的分離鑒定

凝結(jié)芽孢桿菌在熱帶地區(qū)的分布比較廣泛（如：印度等），其主要存在于熱帶沼澤、河流、污水以及某些地域的人和牲畜腸道中。

目前，凝結(jié)芽孢桿菌的分離鑒定主要是以分子鑒定技術(shù)為主，形態(tài)學(xué)及傳統(tǒng)生化特性鑒定為輔，二者相結(jié)合的方法來完成的。第一步，將篩選樣品稀釋并采用天冬酰胺－甘露醇－瓊脂培養(yǎng)基（sparaginemannitol－agar medium）等涂布［5］，通過顯微鏡對菌體進行形態(tài)學(xué)觀察，如：菌體染色是否為革蘭氏陽性，是否可產(chǎn)生端生芽孢，芽孢生成位置以及菌體運動特性等性狀對樣品進行初篩。第二步，經(jīng)過初篩的菌株進行生化特性檢測，如糖發(fā)酵特性，是否為過氧化氫酶陽性，是否僅生成L（＋）－乳酸以及是否吲哚測試和凝膠水解為陰性等特性作進一步篩選。第三，在以上基礎(chǔ)上，主要通過一下方法進行分子鑒定［6］：1）通過檢測菌株DNA 的G＋C 含量是否在44～50%之間；2）測定16SrRNA 基因序列并結(jié)合系統(tǒng)進化分析法對菌株進行鑒定；3）采用DNA 雜交技術(shù)將鑒定菌株與模式菌株或已確認為凝結(jié)芽孢桿菌的菌株（B.coagulans ATCC 7050，MTCC 492等）進行DNA 同源性分析，從而判斷該菌株是否為凝結(jié)芽孢桿菌。

2 凝結(jié)芽孢桿菌的動力學(xué)

凝結(jié)芽孢桿菌以芽孢的形式進入胃消化系統(tǒng)，經(jīng)過胃的蠕動以及胃酸的刺激，芽孢體開始吸水、膨脹，這便啟動了芽孢體的萌發(fā)過程。當(dāng)進入萌發(fā)階段的芽孢到達十二指腸后，芽孢體便徹底轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)細胞，并開始迅速繁殖。伴隨凝結(jié)芽孢桿菌在腸道中的不斷繁殖，大量的代謝產(chǎn)物如：L（＋）－乳酸、凝固素、lactosporin、α－淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶等生成，從而有效地發(fā)揮其益生功效。

研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌芽孢在人體中約4～6 h便可萌發(fā)，其中85%的菌體可順利通過消化系統(tǒng)，最終于腸道中萌發(fā)并繁殖［7］。但值得關(guān)注的是，凝結(jié)芽孢桿菌不同于其它的益生菌，由于菌體在腸道上皮細胞的粘附性較弱，所以在自然條件下一般很難在腸道中存在［8］。因此，作為腸道內(nèi)的“移民”，凝結(jié)芽孢桿菌只能在腸道內(nèi)做短暫的停留，一次性口服凝結(jié)芽孢桿菌后，經(jīng)過大約4～7d時間腸道內(nèi)的凝結(jié)芽孢桿菌便會通過排便而消失殆盡［9］。所以只有持續(xù)服用凝結(jié)芽孢桿菌菌劑，才能使得該菌在腸道中充分發(fā)揮其益生作用。

3 凝結(jié)芽孢桿菌的作用機理

凝結(jié)芽孢桿菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加腸道中有益菌數(shù)量，通過自身代謝產(chǎn)生細菌素抑制并排除致病抗原，增強上皮細胞的存活能力并構(gòu)建完整的生物屏障系統(tǒng)，刺激抗體以及抗炎細胞因子的分泌，增強共生細菌的免疫應(yīng)答，從而有效增強腸道粘膜免疫，從而改善腸道微環(huán)境［10］。

3.1 抑制致病菌

凝結(jié)芽胞桿菌可通過代謝產(chǎn)生大量的L（＋）－乳酸，降低周圍環(huán)境的pH，從而有效地抑制嗜堿性致病菌的生長。除此之外，該菌可產(chǎn)生細菌素及類細菌素物質(zhì)，其中凝固素和lactosporin 為主要抑菌物質(zhì)。

1997年，Le Marrec等［11］從一株由牛糞便中分離到的凝結(jié)芽孢桿菌I4中，發(fā)現(xiàn)了一個約14kb的質(zhì)粒PI4，此質(zhì)粒上攜帶的coa操縱子可進行表達，產(chǎn)生一種凝結(jié)芽孢桿菌特有的抑菌活性的物質(zhì)－凝固素。凝固素為類片球菌素肽類物質(zhì)，分子大小為4 612Da，由44個氨基酸殘基組成，中部氨基酸形成α－螺旋結(jié)構(gòu)，兩端呈無規(guī)則卷曲狀，與片球菌素PA－1／AcH 相似，僅僅是將片球菌素41 號位置C末端的天冬酰胺替換為蘇氨酸［2］。凝固素具有較強的熱穩(wěn)定性，且不受有機溶劑、酯酶及α－淀粉酶影響，但對蛋白水解酶敏感。對腸球菌、酒球菌，明串珠菌，李斯特菌和片球菌具有有效的抑制作用，但與乳球菌和乳桿菌具有良好地協(xié)同效果。

2009年，Riazi 等［12］首次從凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050中分離到一種獨特的脂蛋白類抑菌物質(zhì)－lactosporin。此物質(zhì)的等電點為3.5－4.0，具有良好地?zé)岱€(wěn)定性，但其活性在一定程度上會受環(huán)境中pH 的影響。由于該活性物質(zhì)由脂類和蛋白質(zhì)構(gòu)成，所以在某些脂肪酶和蛋白水解酶存在的條件下，活力會完全喪失。研究表明，lactosporin為陰離子抗菌物質(zhì)，可穿透致病菌細胞表面形成短暫針孔，從而使細胞內(nèi)的K＋等無機鹽離子、氨基酸及ATP泄漏到細胞外。這將細胞的質(zhì)子動力勢的降低，從而抑制病原菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA、RNA 以及肽多糖的代謝［13］，從而對致病菌起到有效的抑制作用。2012年，Shadi Riazi等［14］研究顯示lactosporin對陰道致病菌藤黃微球菌具有有效的殺滅效果，而對大多數(shù)非致病菌無抑制作用。

3.2 提高機體免疫能力

凝結(jié)芽胞桿菌可抑制由活性氧誘導(dǎo)的氧化作用，并可增強中性粒（PMN）細胞的巨噬細胞活性。研究者分別對凝結(jié)芽孢桿菌的細胞壁構(gòu)成物質(zhì)以及發(fā)酵上清液進行研究，發(fā)現(xiàn)二者均可通過調(diào)節(jié)細胞因子提高腸道免疫能力，抑制活性氧，增強細胞吞噬作用［15］。

凝結(jié)芽孢桿菌可對細胞因子的分泌進行調(diào)控，可誘導(dǎo)細胞因子IL－4，IL－6、IL－10、TNF－α和IFNγ，并抑制IL－2 的產(chǎn)生。Jensen 等［16］通過研究發(fā)現(xiàn)，該菌可以誘導(dǎo)NK 細胞CD69表達，從而激活細胞CD3－CD56＋，且當(dāng)凝結(jié)芽孢芽暴露在腫瘤細胞中時，可加強NK 細胞CD107a的表達。研究還發(fā)現(xiàn)，B.coagulans GBI－30－6086 會對腺病毒以及A型流感病毒的侵入做出快速反應(yīng)并促進人體產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF－α），經(jīng)過30d后，TNF－α的水平含量分別達到了原來的2.5和17.09倍［17］。這說明凝結(jié)芽孢桿菌對機體具有有效的免疫調(diào)節(jié)作用。

3.3 促進機體消化代謝

凝結(jié)芽孢桿菌具有龐大的酶系統(tǒng)，可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及木聚糖酶等活性物質(zhì)［18］，從而有助于增強胃腸道對食物的消化吸收能力，提高食物的轉(zhuǎn)化利用率。

此外，凝結(jié)芽孢桿菌還可產(chǎn)生β－半乳糖苷酶及乳酸脫氫酶，因此可有助于乳糖不耐受癥人群對乳糖的消化［19］。凝結(jié)芽孢桿菌可結(jié)合并利用膽固醇合成細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而且對膽固醇生成酶3－羥基－3－甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG－CoA reductase）［20］起到一定的抑制作用，這將降低血液中的膽固醇含量，從而防止由于高膽固醇而引起的疾病。

4 凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用

4.1 凝結(jié)芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

凝結(jié)芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面應(yīng)用比較廣泛。袁豐華等［21］研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌可促進尖吻鱸的生長，并提高其腸道淀粉酶及胃蛋白酶的活性，但對血清免疫酶的影響較小。該菌可顯著提高奧尼羅非魚腸道、肝胰臟和胃的蛋白酶活性［22］。腸道內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量可顯著提高團頭魴的生長率、蛋白質(zhì)效率和蛋白酶活力，可顯著降低飼料系數(shù)和腸道大腸埃希菌數(shù)量［23］。

Ringo等［24］發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高錦鯉的體重，添加凝結(jié)芽孢桿菌的錦鯉體重較對照組高約8.3g／尾，存活率提高2.7%。這是由于添加益生菌后，增強了腸道對維生素的合成能力以及消化酶的活力。值得注意的是，凝結(jié)芽孢桿菌與殼寡糖混合使用效果會更加明顯。此外，凝結(jié)芽孢桿菌可顯著增強錦鯉呼吸強度和巨噬細胞的活性，并且明顯提高血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性，從而提高錦鯉對致病菌侵染的抵抗力，對錦鯉免疫力的提高起到了關(guān)鍵性作用。

4.2 凝結(jié)芽孢桿菌在禽類養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

2010年，Zhou 等［25］采用凝結(jié)芽孢桿菌ZJU0616作為益生菌添加劑飼喂廣西黃雞，并對雞的生長特性、飼料轉(zhuǎn)化率、存活率、肉質(zhì)化學(xué)成分以及肉的品質(zhì)進行了系統(tǒng)的分析。其中，飼料中凝結(jié)芽胞桿菌的添加量分別為1.0×106cfu／g、2.0×106cfu／g和5.0×106cfu／g。實驗結(jié)果顯示，凝結(jié)芽胞桿菌可顯著提高黃雞的日增重、出欄體重和飼料轉(zhuǎn)化率，明顯改善肉質(zhì)品質(zhì)，并且實驗組黃雞的存活率較對照組提高了4%～7%。值得注意的是，飼料中不同的凝結(jié)芽孢桿菌添加量并沒有導(dǎo)致最終各項檢測指標(biāo)之間的顯著差異，這說明當(dāng)腸道內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌的含量達到一定值后，菌體在腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物所發(fā)揮的益生功效將會占據(jù)主導(dǎo)地位。

無獨有偶，Cavazzoni等［26］對凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞的生長情況的影響進行研究，結(jié)果顯示添加該益生菌可降低死亡率，提高飼料利用率，顯著增加肉雞日增體重及出欄體重。這說明凝結(jié)芽胞桿菌對雞的生長特性及機體免疫功能具有比較顯著影響。

4.3 凝結(jié)芽孢桿菌在畜類養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

微生態(tài)制劑不但能提高機體的生長性能，而且還能降低腸桿菌科細菌在胃腸道各部位定植水平而影響腸道菌群的微生態(tài)平衡，采用凝結(jié)芽孢桿菌飼喂仔豬可顯著降低其死亡率，并提高飼料轉(zhuǎn)化率。1998年，Annunciata等［27］以凝結(jié)芽胞桿菌CNCM I－1061飼喂乳豬，并對乳豬糞便中乳球菌、腸球菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、梭菌以及擬桿菌屬等菌群的變化情況進行了研究。實驗結(jié)果顯示，凝結(jié)芽胞桿菌可以穩(wěn)定的定植于腸道中，顯著抑制厭氧球菌、擬桿菌屬及大腸桿菌的生長，而對乳酸菌和雙歧桿菌的生長無明顯的抑制效果。

周映華等［28］研究了凝結(jié)芽孢桿菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響，試驗表明：在飼料中添加0.05%凝結(jié)芽孢桿菌較添加0.1%枯草芽孢桿菌的試驗效果好，凝結(jié)芽胞桿菌可明顯增加腸道內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量，并抑制大腸桿菌的生長。

4.4 凝結(jié)芽孢桿菌在臨床方面的應(yīng)用

2007年，Johnston 等［29］通過大量分析總結(jié)指出，凝結(jié)芽孢桿菌是在治療抗生素相關(guān)性腹瀉方面最有應(yīng)用價值的益生菌種。2003年，La Rosa等［30］綜合采用隨機法、雙盲法和安慰劑控制試驗對凝結(jié)芽孢桿菌在治療抗生素相關(guān)性腹瀉的效果進行研究。試驗將98名患病兒童隨機分為兩組，分別服用凝結(jié)芽孢桿菌－果糖－低聚糖制劑和安慰劑10d，結(jié)果顯示實驗組的治愈率為71%，顯著高于對照組的38% ，且試驗組的腹瀉持續(xù)時間為0.7d，明顯少于安慰劑組的1.6d。這說明凝結(jié)芽孢桿菌在治療此疾病方面具有良好地功效。

2003年，Katsutoshi等［31］對口服凝結(jié)芽孢桿菌SANK 70258進行研究，發(fā)現(xiàn)此菌可改善糞便的形狀和顏色（由黑色變?yōu)槲ⅫS色）；可通過降低腸道內(nèi)氨類物質(zhì)，吲哚以及對－甲酚，以減弱糞便的臭味；可顯著降低排便的頻率以及糞便的pH，可提高腸道內(nèi)雙歧桿菌的活菌數(shù)并抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長。

腸道應(yīng)激性綜合征（IBS）是由于腸道菌群失調(diào)而引起的腸粘膜損傷，導(dǎo)致腸道免疫功能紊亂而引發(fā)的一系列腸道疾?。?2］。Dolin［33］通過對51 位腸道應(yīng)激性綜合征患者進行8周的研究，發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌GBI－30，6086可明顯改善患者的胃脹、腹絞痛、便秘等情況。Kalman等［34］對凝結(jié)芽孢桿菌研究發(fā)現(xiàn)，服用該菌后可顯著改善由于炎癥引起的腸炎疼痛以及飯后引起的腹脹不適現(xiàn)象，這一點與Hun Larysa的研究結(jié)果相一致［35］。

此外，凝結(jié)芽孢桿菌對新生嬰兒腹瀉［36］、高脂血癥、口瘡性口炎、齲齒［37］、陰道炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［38］均有顯著治療效果。

5 凝結(jié)芽孢桿菌的毒副作用及用量

通過對凝結(jié)芽孢桿菌的毒理學(xué)安全性評估結(jié)果進行分析，表明此菌對機體無致誘變，致畸變以及遺傳毒性效應(yīng)。2009年，Endres等［3］采用大鼠對凝結(jié)芽孢桿菌在急性和慢性的口腔毒理進行研究，試驗結(jié)果顯示活菌數(shù)服用量大于1.36×1011CFUs／g／kg（體重）／天無任何不良副作用。

一般來說，凝結(jié)芽孢桿菌在飼料中的添加量達到1×106CFUs／g，便可起到良好地效果。而對于一個體重70kg的人來說，推薦的每天標(biāo)準(zhǔn)服用劑量100mg（含活菌數(shù)約15億），分2～3次服用。

6 展望

國外對于凝結(jié)芽孢桿菌的研究已有70多年的歷史，而我國還僅僅處在起步階段。凝結(jié)芽孢桿菌對動物機體具有良好的益生作用，且較傳統(tǒng)的乳酸菌益生菌更具有優(yōu)異的儲存特性，相信伴隨人們研究的不斷深入，凝結(jié)芽孢桿菌將會在臨床和養(yǎng)殖方面發(fā)揮越來越重要的作用。

目前，國內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌制劑主要是通過液體發(fā)酵方式獲得，發(fā)酵過程中的多種生理活性物質(zhì)成分，如有機酸、水解酶、維生素、天然抗活性物質(zhì)和促生長因子菌隨分離的上清液放掉，同時又增加了對污水治理的負擔(dān)，浪費了資源。故而，凝結(jié)芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵及與其他益生菌混菌固態(tài)發(fā)酵亟待深入研究。凝結(jié)芽孢桿菌在療效相關(guān)疾病中的作用并非決定性的，相關(guān)機理仍待深入研究；凝結(jié)芽孢桿菌在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用，當(dāng)根據(jù)不同動物種類及動物的生長時期而添加不同的劑量，相關(guān)研究需系統(tǒng)、全面的展開，以便為實際生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

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