劉海冰，孔枕枕，趙培培，茅凌翔，蘇兆亮，陳建國(guó)

（1．江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2．江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；3．鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心，江蘇鎮(zhèn)江212004）

干擾EV71病毒2Apro基因的siRNA具有潛在的抗病毒作用

劉海冰1，孔枕枕2，趙培培2，茅凌翔3，蘇兆亮2，陳建國(guó)1

（1．江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2．江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；3．鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心，江蘇鎮(zhèn)江212004）

目的：探討以腸病毒71（entrovirus 71，EV71）2A蛋白酶（2A）基因?yàn)榘行蛄泻铣傻膕iRNA是否具有潛在的抗病毒作用。方法：用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體分別將40、60、80 nmol／L FITC標(biāo)記的BLOCK-iT Fluorescent Oligo轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡檢測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率。將化學(xué)合成的3個(gè)siRNA-2Apro（siRNA-69、294、319）和陰性對(duì)照的亂序si-RNA（siRNA-SCS）轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，siRNA-2Apro為實(shí)驗(yàn)組，siRNA-SCS為陰性對(duì)照組，另設(shè)模擬轉(zhuǎn)染組，僅用脂質(zhì)體處理；用EV71分別感染各組RD細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)病毒RNA和VP1蛋白。結(jié)果：當(dāng)siRNA濃度為60 nmol／L時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)87%。細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞只發(fā)生了輕微的病變。熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，siRNA-2Apro組的病毒RNA和VP1蛋白明顯低于對(duì)照組（P＜0．01）。結(jié)論：以EV71 2Apro基因?yàn)榘行蛄谢瘜W(xué)合成的siRNA能有效地抑制病毒的復(fù)制。

腸病毒71；RNA干擾；siRNA；2Apro基因；病毒抑制

腸道病毒71（enterovirus 71，EV71）屬于小RNA 病毒科腸道病毒A組，是手足口病的主要病原體之一［1］，感染多發(fā)生于5歲以下兒童，重癥感染患兒常出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥，甚至死亡［2］。迄今為止，尚缺乏特異、高效的抗病毒藥物治療EV71引發(fā)的感染［3］，因此，尋找一種潛在有效的治療方案顯得十分必要。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)已成為抑制多種病毒復(fù)制的有效方法，為治療EV71引起的手足口病提供了重要手段。EV71 2A蛋白酶（2Apro）基因序列具有高度保守的特性，且與病毒的致病性直接相關(guān)，故推測(cè)以該序列為靶點(diǎn)的siRNA可能具有潛在的抗病毒作用。本實(shí)驗(yàn)以2Apro基因?yàn)榘袠?biāo)，體外驗(yàn)證siRNA-2Apro是否具有抑制EV71病毒復(fù)制的能力。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒株

RD細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。EV71病毒株由鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。

1．2 siRNA的設(shè)計(jì)與合成

以EV71的2Apro基因序列（JN001860．1）為靶的3個(gè)siRNA由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成，作為陰性對(duì)照的亂序siRNA（siRNA-SCS）與其中一個(gè)siRNA序列組成相同，但與靶基因沒有明顯的同源性。FITC標(biāo)記的BLOCK-iT Fluorescent Oligo作為綠色熒光對(duì)照，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。合成的siRNA用去RNA酶水溶解成20 nmol／L后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 siRNA轉(zhuǎn)染和EV71感染

主要步驟：a．轉(zhuǎn)染前1 d，將RD細(xì)胞種植于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔400μL細(xì)胞懸液，密度為5 ×104細(xì)胞／孔，用不含抗生素的培養(yǎng)基于37℃，5% CO2孵育過(guò)夜。用預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基400μL替換每孔中舊培養(yǎng)基，另培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)50%左右，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行孔。b．將60 nmol／L siRNA溶于50μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，稀釋混勻，室溫靜置5 min。c．將2μL Lipofectamine 2000溶于50μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，稀釋混勻，室溫靜置5 min。d．將b和c步驟中所得混合液混勻，室溫靜置20 min，加入24孔板中，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。e．6 h后棄培養(yǎng)基，加入含2%胎牛血清的DMEM，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。f．轉(zhuǎn)染24 h后用感染復(fù)數(shù)（MOI）為0．01的EV71感染細(xì)胞。

1．4 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

FITC標(biāo)記的BLOCK-iT Fluorescent Oligo用于檢測(cè)siRNA的最適轉(zhuǎn)染效率。按上述轉(zhuǎn)染步驟將不同濃度（40，60，80 nmol／L）的BLOCK-iT Fluorescent Oligo與2μL Lipofectamine 2000混合物轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，24 h后于倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。隨后胰酶消化細(xì)胞，移至EP管中，離心，PBS洗3次，轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1．5 細(xì)胞病變效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)分為6組，分別為siRNA-69組，siRNA-294組，siRNA-319組，siRNA-SCS組，模擬轉(zhuǎn)染組（僅用Lipofectamine 2000處理），病毒處理組。按上述轉(zhuǎn)染步驟分別對(duì)各組轉(zhuǎn)染60 nmol／L相對(duì)應(yīng)的siRNA，24 h后用0．01 MOI的EV71感染，48 h后于倒置顯微鏡下觀察各組RD細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1．6 熒光定量PCR檢測(cè)病毒RNA

用于熒光定量PCR的引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，擴(kuò)增片段為EV71 2A基因序列（136～318 bp），用該片段作標(biāo)準(zhǔn)品，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物序列：上游，5′-ACTGCCCAAGGTTGTGAC-3′，下游，5′-TTCTGAGTGACCCTGTGC-3′。按“1．3”步驟轉(zhuǎn)染siRNA，然后用EV71感染，24 h后用Easy Pure Viral DNA／RNA Kit（Transgen Biotech）嚴(yán)格按照說(shuō)明書提取病毒RNA。取8μL總RNA，按照Easy Script Firststrand cDNA Synthesis Super Mix（Transgen Biotech）說(shuō)明書嚴(yán)格操作，獲得20μL cDNA溶液。取8μL cDNA模板，按照Thermo Scientific DyNAmo Color-Flash SYBR Green qPCR Kit（Thermo Scientific）操作行熒光定量PCR，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒RNA的量。

1．7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)病毒蛋白

各組RD細(xì)胞感染病毒36 h后，用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞并收集病毒VP1蛋白。等量蛋白行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉1 h，抗VP1抗體4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再加入酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后加顯色劑ECL-plus曝光，觀察結(jié)果。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 siRNA序列

以EV71的2Apro基因序列為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成3個(gè) siRNA，分別為siRNA-69、siRNA-294和siRNA-319。通過(guò)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，3個(gè)siRNA對(duì)靶基因高度特異且與人類基因無(wú)同源性。相關(guān)siRNA信息如表1所示。

2．2 轉(zhuǎn)染效率

如圖1所示，當(dāng)BLOCK-iT Fluorescent Oligo濃度為60 nmol／L時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)87%；40 nmol／L時(shí)由于濃度偏低，細(xì)胞熒光強(qiáng)度較暗；80 nmol／L時(shí)，轉(zhuǎn)染效率反而降低。因此，選擇60 nmol／L siRNA作為最適轉(zhuǎn)染濃度進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)。

2．3 siRNA抑制EV71引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

如圖2所示，siRNA-SCS組、模擬轉(zhuǎn)染組和病毒組的RD細(xì)胞出現(xiàn)濃縮、變圓、核皺縮等形態(tài)學(xué)改變，而siRNA-69、siRNA-294和siRNA-319組的RD細(xì)胞僅出現(xiàn)了輕微的細(xì)胞病變。結(jié)果表明，3個(gè)siRNA具有抑制EV71的能力，可保護(hù)由病毒引起的RD細(xì)胞病理改變。

2．4 siRNA抑制EV71的RNA和蛋白表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，siRNA-69、294和319處理組的病毒RNA量明顯降低，且siRNA-69組抑制能力最強(qiáng)，siRNA-294組相對(duì)較弱，siRNA-319組抑制效果最差（圖3）。VP1蛋白是EV71衣殼蛋白之一，檢測(cè)其表達(dá)可驗(yàn)證病毒RNA量降低是否會(huì)導(dǎo)致病毒蛋白相應(yīng)下調(diào)。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，各siRNA處理組VP1蛋白表達(dá)量明顯降低，且各siRNA的抑制能力與熒光定量PCR結(jié)果相一致。見圖4。

3 討論

RNAi是由高度保守的雙鏈小干擾RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后同源mRNA特異性降解的基因沉默現(xiàn)象［4］。其中，siRNA作用靶點(diǎn)的選擇是該技術(shù)成功治療疾病的關(guān)鍵，既要有高度保守的特性，又要其編碼的蛋白質(zhì)具有重要的生理功能。EV71基因組為只含有一個(gè)開放閱讀框的單股正鏈RNA，約7 400 bp，可編碼含2 194個(gè)氨基酸的多聚蛋白；后者在自身水解產(chǎn)生的蛋白酶切割作用下產(chǎn)生P1、P2和P3三個(gè)前體蛋白，隨后再經(jīng)一系列加工，P1前體蛋白形成VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，最終構(gòu)成病毒的外殼。P2和P3前體蛋白編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：2A、2B、2C、3A、VPg、3C和3D［5］。研究表明，靶向EV71基因組VP1、3′UTR、2C、3C和3D區(qū)域的siRNA能夠有效抑制EV71感染，但大多數(shù)靶點(diǎn)序列在中國(guó)EV71流行株基因組中并不保守［6－9］，因此，不具有抗EV71中國(guó)流行株的廣譜效能。為此，有必要重新選擇靶基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)siRNA。

2Apro具有半胱氨酸蛋白酶活性，在病毒的復(fù)制和致病過(guò)程中起重要作用。EV71感染宿主細(xì)胞后，能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)真核生物翻譯起始因子4GI（eIF4GI）和DNA修復(fù)酶PARP發(fā)生裂解，從而阻止宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯，加強(qiáng)病毒本身的轉(zhuǎn)錄和翻譯［10］。此外，EV71的2Apro還具有抑制干擾素的作用，從而逃脫宿主細(xì)胞的免疫清除［11］，促進(jìn)自身物質(zhì)的大量合成，產(chǎn)生大量子代病毒，當(dāng)積累到一定數(shù)量時(shí)，通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡信號(hào)導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，加快病毒的進(jìn)一步傳播。由于2Apro基因序列具有高度保守性，因此，推測(cè)以該序列為靶點(diǎn)的siRNAs可能具有潛在的抗EV71效能。

本研究針對(duì)EV71 2Apro基因序列設(shè)計(jì)合成3個(gè)siRNA，結(jié)果表明均具有抑制EV71復(fù)制的能力，且能有效保護(hù)感染EV71細(xì)胞的活力，抑制效果為siRNA-69＞siRNA-294＞siRNA-319。上述抗病毒能力的差異，可能是由于各siRNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性不同，導(dǎo)致形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的能力也有所不同；其次，RNA連接蛋白可能引起siRNA對(duì)靶位點(diǎn)的結(jié)合能力下降；也可能由于靶序列不同的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)引起的空間阻力不同，導(dǎo)致與siRNA結(jié)合的難易程度也不同［12］。

根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究初步證實(shí)siRNA-2Apro具有高效的抑制病毒復(fù)制的能力，然而，該siRNA在體內(nèi)是否具有相同的抗病毒能力還有待進(jìn)一步研究。另外，要有效地將該siRNA應(yīng)用于體內(nèi)治療，仍面臨著許多障礙，比如血液或組織中核酸酶的降解、腎臟的快速清除以及引起的組織毒性或免疫反應(yīng)等［13－14］。尤其重要的是少數(shù)EV71感染患兒可引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如何將siRNA通過(guò)血腦脊液屏障到達(dá)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮干擾作用仍是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。

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siRNA against the 2Aprogenom ic region of EV71 exerts potential antiviral effects

LIU Hai-bing1，KONG Zhen-zhen2，ZHAO Pei-pei2，MAO Ling-xiang3，SU Zhao-liang2，CHEN Jian-guo1
（1．Department of Clinical Laboratory，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2．School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；3．Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention，Zhenjiang Jiangsu 212004，China）

Objective：To explore whether siRNA targeted the 2A protease genomic（2Apro）region of enterovirus 71（EV71）possesses potential antiviral effects．M ethods：RD cells were transfected with 40，60 and 80 nmol／L BLOCK-iT Fluorescent Oligo labeled with FITC，transfection efficiency of siRNA was detected by flow cytometry and fluorescencemicroscopy．RD cellswere transfected with three siRNA-2Apro（siRNA-69，294，319），the experimental group，and siRNA-SCS，the negative group；the MOCK group only dealed with Lipofectamine 2000．Morphological changes of RD cells in each group were observed under the microscopy，viral RNA and protein were tested by quantitative RT-PCR and western blotting，respectively．Results：Themaximal transfection efficiency occurred when the siRNA concentration was at60 nmol／L，the transfection efficiency was up to 87%．RD cells of siRNA-2Aprogroup showed slight cytopathic effect and a higher cell survival rate compared to control groups，through the observation of themorphological changes of the cells infected with EV71．The results of quantitative RT-PCR and western blotting revealed that the levels of viral RNA and protein of siRNA-2Aprogroup were significantly lower than the control group（P＜0．01）．Conclusion：siRNAs targeted the 2Aprogenomic region of EV71 exerts potential antiviral effects．

enterovirus 71；RNA interference；siRNA；2Aprogene；viral inhibition

R373．2；R393

A

1671－7783（2014）05－0403－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140090pro

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81370084）；鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（SH2012036）

劉海冰（1987—），男，碩士研究生；陳建國(guó)（通訊作者），主任技師，E-mail：cjg02＠126．com

2014－04－07 ［編輯］劉星星