霍中華，胡君，儲(chǔ)著陵，呂勝，尹鵬，章麗

（解放軍第454醫(yī)院普外科，江蘇南京210002）

薯蕷皂苷元體內(nèi)外抑制胃癌增殖的機(jī)制

霍中華，胡君，儲(chǔ)著陵，呂勝，尹鵬，章麗

（解放軍第454醫(yī)院普外科，江蘇南京210002）

目的：研究薯蕷皂苷元抑制胃癌增殖及轉(zhuǎn)移的主要途徑及其機(jī)制。方法：分別使用1，10，100μg／mL濃度薯蕷皂苷元處理人血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和胃癌BGC-823細(xì)胞，制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察薯蕷皂苷元對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；選取一定濃度的薯蕷皂苷元處理HUVEC和BGC-823細(xì)胞，體外成管實(shí)驗(yàn)和劃線法分別檢測(cè)藥物處理對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管能力及腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。將BGC-823細(xì)胞接種到裸鼠制作皮下腫瘤模型，連續(xù)靜脈注射薯蕷皂苷元，分析比較其對(duì)皮下腫瘤的抑制效果。結(jié)果：與對(duì)照組比較，薯蕷皂苷元可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性（P＜0．05），且具有濃度依賴性；而相同處理方式對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖活性基本無(wú)影響；10μg／mL的薯蕷皂苷元對(duì)BGC-823細(xì)胞的遷移能力具有明顯的抑制作用，能夠明顯抑制HUVEC細(xì)胞體外成管能力；與模型組比較，薯蕷皂苷元給藥組腫瘤抑制率明顯增高（達(dá)38．2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論：薯蕷皂苷元可以通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性影響腫瘤血供，并最終抑制皮下腫瘤模型的增殖，同時(shí)，其可通過(guò)直接的作用抑制胃癌的遷移。

薯蕷皂苷元；人血管內(nèi)皮細(xì)胞；BGC-823細(xì)胞；增殖活性；體外成管；遷移；裸鼠成瘤

胃癌的發(fā)病率近年來(lái)呈現(xiàn)年輕化、擴(kuò)大化的趨勢(shì)，然而多年來(lái)，其治療手段卻沒(méi)有根本性的改變［1］，外科手術(shù)配合化學(xué)療法是目前胃癌治療的主要手段。手術(shù)療法受到患者具體情況的限制，化學(xué)療法也始終伴隨著嚴(yán)重的不良反應(yīng)?；瘜W(xué)藥物的大量長(zhǎng)期使用，還有可能導(dǎo)致染色體畸形，具有臟器損害及致畸等潛在危險(xiǎn)。因此，近年來(lái)天然植物成分逐漸成為抗腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。薯蕷皂苷是從薯蕷科植物穿龍薯蕷的根中分離出的一種植物甾體化合物，其抗癌活性首先發(fā)現(xiàn)于云南白藥［2］。而Chiang等［3］則通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)從紫花茄中提取的薯蕷皂苷對(duì)結(jié)腸癌、鼻咽癌、宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。王麗娟等［4］研究了薯蕷皂苷在體內(nèi)外的抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)肉瘤、肝癌、宮頸癌細(xì)胞及裸鼠皮下移植瘤均有明顯抑制作用。HU等［5］則系統(tǒng)觀察了薯蕷皂苷元的抗癌作用，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元對(duì)大多數(shù)血癌和實(shí)體瘤都表現(xiàn)出抑制活性。近期研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［6－8］，這種抑制能力可能是通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1-α）的活性實(shí)現(xiàn)的［9－10］。

薯蕷皂苷元對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的影響，以及是否通過(guò)對(duì)血管生成的影響進(jìn)而影響腫瘤的形成及發(fā)展過(guò)程，目前未見(jiàn)有詳細(xì)報(bào)道。本研究比較了薯蕷皂苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，且建立了裸鼠胃癌模型，初步分析薯蕷皂苷是否通過(guò)影響血管生成進(jìn)而影響胃癌形成和發(fā)展，以及可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

HUVEC細(xì)胞購(gòu)自上?？蠌?qiáng)生物科技有限公司，BGC-823細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞所；基質(zhì)膠、細(xì)胞培養(yǎng)耗材為BD公司產(chǎn)品；胎牛血清，0．25%胰蛋白酶，RPMI-1640培養(yǎng)基均為Invitrogen公司產(chǎn)品；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品，移液器、離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；裸鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；薯蕷皂苷元為美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞及HUVEC增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823及HUVEC細(xì)胞，胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使用添加10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)／mL，接種細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入終濃度為1、10和100μg／mL的薯蕷皂苷元。接種后正常條件培養(yǎng)24、48及72 h，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。每孔加入10μL的CCK-8溶液，置于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度值。

1．2．2 薯蕷皂苷元對(duì)BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后使用血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，使用完全培養(yǎng)基（RPMI-1640＋10%FBS）調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL，接種細(xì)胞到6孔板，每孔添加2 mL細(xì)胞懸液，37℃和5%CO2濃度下培養(yǎng)24 h，使用無(wú)菌200μL槍頭劃痕，無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液2 mL，正常條件培養(yǎng)；劃線后24、48和72 h分別進(jìn)行顯微鏡攝影，觀察細(xì)胞遷移狀況。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入終濃度為1、10和100μg／mL的薯蕷皂苷元。

1．2．3 薯蕷皂苷元對(duì)HUVEC成管的影響 實(shí)驗(yàn)的前1天，將基質(zhì)膠置于4℃融化，同時(shí)將滅菌的10μL槍頭、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于4℃冷藏備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，從冰箱中取出冷藏的槍頭和培養(yǎng)板，在培養(yǎng)板每個(gè)孔中加入100μL基質(zhì)膠，注意保持槍頭垂直于孔中間位置，基質(zhì)膠一直保持放在冰上。輕晃培養(yǎng)板使膠分布均勻，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，放置30 min使膠凝固。在膠凝固的過(guò)程中，可以開(kāi)始準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞消化后將細(xì)胞懸液密度調(diào)整到2×105個(gè)／mL。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，每孔加入50μL細(xì)胞懸液，蓋上蓋子后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后進(jìn)行顯微鏡攝影，每組任選5個(gè)視野，計(jì)算其中閉合狀結(jié)構(gòu)的數(shù)目，求取平均值后進(jìn)行組間比較。

1．2．4 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌細(xì)胞裸鼠模型的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，1 000×g離心2 min收集沉淀，使用DPBS重懸細(xì)胞2次，再用DPBS制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并使用DPBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×108個(gè)／mL，冰浴保存。無(wú)菌1 mL注射器吸取0．1 mL細(xì)胞懸液，接種到5周齡裸鼠腋下。接種后第10天，皮下可見(jiàn)有瘤體形成，直徑約2．5 mm。給藥組通過(guò)尾靜脈注薯蕷皂苷元，每次用量為50 mg／kg（根據(jù)臨床人體使用量的10倍給藥），每2天注射1次，直至接種后第4周，共注射7次。拉頸處死小鼠，剝離腫瘤（去掉瘤體上的脂肪及血管、淋巴管組織），進(jìn)行瘤體稱(chēng)重，計(jì)算腫瘤抑制率。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用析因分析進(jìn)行組間差異及組內(nèi)差異的比較。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌細(xì)胞及HUVEC增殖活性的影響

比較不同處理組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，1，10，100μg／mL的薯蕷皂苷元可明顯抑制HUVEC細(xì)胞增殖活性，且具有濃度依賴性；其中48和72 h，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01或P＜0．05）；而同樣濃度的薯蕷皂苷元處理，對(duì)BGC-823增殖活性則無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖1。

2．2 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823遷移能力的影響

按照前面的活性抑制實(shí)驗(yàn)，選擇最低有效濃度10μg／mL的薯蕷皂苷元進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。通過(guò)比較同一視野細(xì)胞向線內(nèi)遷移的速度，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能明顯抑制BGC-823細(xì)胞的遷移能力。見(jiàn)圖2。

2．3 薯蕷皂苷元對(duì)HUVEC體外成管的影響

HUVEC經(jīng)10μg／mL的薯蕷皂苷元處理后，與對(duì)照組比較，成管數(shù)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2．91，P＜0．05）。結(jié)果顯示，薯蕷皂苷元可明顯抑制HUVECDE成管能力。見(jiàn)圖3

2．4 薯蕷皂苷元對(duì)裸鼠皮下胃癌模型的影響

與模型組比較，給藥組腫瘤明顯受到抑制，其抑制率達(dá)到38．2%（χ2＝3．31，P＜0．05）；鹽水對(duì)照組與模型組比較，抑制率無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖4。

3 討論

腫瘤從某種意義上來(lái)說(shuō)是系統(tǒng)疾病的局部表現(xiàn)，使用單一的療法，很難根治。而以目前腫瘤治療的主要手段來(lái)看，手術(shù)切除、化療放療均會(huì)產(chǎn)生比較明顯的不良反應(yīng)。另外，術(shù)后復(fù)發(fā)的問(wèn)題也一直困擾著醫(yī)療人員和患者。天然藥物因其低毒副作用，可以作為腫瘤治療和輔助治療的有效藥物。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多種植物及其有效成分具有抑制腫瘤的作用。如人參苷具有預(yù)防腫瘤、抗氧化、參與受損傷細(xì)胞修復(fù)和再生、腫瘤生物學(xué)逆轉(zhuǎn)等作用。

薯蕷皂苷元抗腫瘤的主要途徑是通過(guò)對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道、腫瘤特異性因子以及一些與腫瘤生長(zhǎng)、分化、凋亡和變異相關(guān)的分子進(jìn)行調(diào)控，從而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行控制［11］。Moalic等［12］的研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元在人類(lèi)骨肉瘤pression 1547細(xì)胞中有抑制COX-2的活性和蛋白表達(dá)的作用。Raju等［13］研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元也可以通過(guò)干擾細(xì)胞HMG-CoA還原酶的膽固醇生物合成途徑，誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞的凋亡，并且存在劑量依賴性。薯蕷皂苷對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性，所以其對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性可能是特異性的［7］。薯蕷皂苷元在體內(nèi)和體外均能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29及畸變隱窩灶細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)抑制bcl-2及誘導(dǎo)caspase-3蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的［14］。

本研究中，我們使用薯蕷皂苷元同時(shí)處理了胃癌BGC-823細(xì)胞及HUVEC，細(xì)胞活性檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，相同濃度的薯蕷皂苷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性具有明顯的抑制作用，而對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖活性基本無(wú)影響。裸鼠體內(nèi)移植腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)表明，薯蕷皂苷元能夠明顯抑制移植瘤的生長(zhǎng)，這與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果明顯不同。因此，我們認(rèn)為薯蕷皂苷元對(duì)BGC-823的增殖不產(chǎn)生直接影響，其對(duì)體內(nèi)腫瘤增殖的抑制作用，應(yīng)該是通過(guò)抑制腫瘤內(nèi)血管的生成，從而影響腫瘤的血供實(shí)現(xiàn)的。在本研究中，我們還進(jìn)行了細(xì)胞遷移檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷能明顯抑制BGC-823細(xì)胞的遷移能力。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薯蕷皂苷抑制胃癌細(xì)胞遷移能力與其抑制細(xì)胞增殖活性之間是沒(méi)有相關(guān)性的。

綜上所述，薯蕷皂苷元具有較好的抗腫瘤作用，其對(duì)胃癌生長(zhǎng)的抑制機(jī)制不是單純的通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用而實(shí)現(xiàn)的，可能是多途徑的。因此我們認(rèn)為薯蕷皂苷元作為化療的輔助用藥可增加化療藥的治療效果，符合未來(lái)中藥的發(fā)展方向。鑒于其對(duì)胃癌細(xì)胞本身并無(wú)明顯抑制作用，因此可減少對(duì)癌旁組織和細(xì)胞的損傷。盡管它與抗腫瘤有關(guān)的途徑不斷被發(fā)現(xiàn)，但其通過(guò)抑制血管生成而影響體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)途徑對(duì)我們后續(xù)的研究仍然具有積極的意義，如在篩選腫瘤抑制藥物時(shí)，不能將細(xì)胞活性作為唯一的參考標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)抗血管生成藥物的研究，則可以為胃癌臨床治療中，盡可能減少對(duì)癌旁組織的損傷提供了新的思路。

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M echanism underlying inhibition ofm igration of gastric carcinoma by diosgenin in vitro and vivo

HUO Zhong-hua，HU Jun，CHU Zhu-ling，LV Sheng，YIN Peng，ZHANG Li
（Department of General Surgery，the 454th Hospital of PLA，Nanjing Jiangsu 210002，China）

Objective：To investigate the principal pathway and preliminarymechanism by which diosgenin inhibits gastric carcinoma in vivo by treatment of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）and gastric carcinoma（BGC-823）cells for comparison．M ethods：HUVEC and BGC-823 cells were treated with diosgenin at different concentrations and cell growth curveswere plotted to observe the effects of diosgenin on proliferative activities of endothelial cells and gastric carcinoma cells；the scraping linemethod and canalization in vitro were used to detect the effects of diosgenin treatment on canalization of endothelial cells and migration ability of gastric carcinoma cells by treating HUVEC and BGC-823 cells with diosgenin at a certain concentration；a subcutaneous tumormodel was established by inoculating nudemice with BGC-823 cells and diosgenin was administrated continuously to analyze its inhibitory effects on subcutaneous tumors．Results：Diosgenin had a significant effect on proliferation of endothelial cells in a concentration-dependent way，with a significant difference between the treatment groups and the control group at 48 or 72 h（P＜0．05）；and the same treatment had no evident effect on the proliferative activity of BGC-823 cells and effectively inhibited themigration of BGC-823 cells and significantly reduced the canalization of HUVEC cells in vitro；diosgenin exhibited a good inhibitory effect on subcutaneous tumors in the nudemicemodel of BGC-823 cells at an inhibitory rate of38．2%（P＜0．05）in comparison with themodel group．Conclusion：Diosgenin can eventually inhibit the proliferation of the subcutaneous tumormodel by suppressing endothelial cell activity and consequently suppressing blood supply．

book=395,ebook=32

diosgenin；human umbilical vein endothelial cells；BGC-823 cell；viability；capillary like tube formation；cellularmigration；nudemouse transplantation tumor

R979．19

A

1671－7783（2014）05－0394－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140213

霍中華（1970—），男，安徽太和人，主任醫(yī)師，博士，主要從事消化道腫瘤的診治研究。

2014－07－29 ［編輯］陳海林