王恒秋 劉雨峰 王雙 胡志方

快速K-B法細菌藥物敏感試驗抑菌環(huán)直徑改變規(guī)律及對判斷結果的影響

王恒秋1劉雨峰1王雙2胡志方1

目的 探討快速K-B法細菌藥物敏感試驗（antibiotic susceptibility test，AST）抑菌環(huán)直徑改變的規(guī)律以及對判斷結果的影響。方法收集我院2013年1月-2014年9月分離自門診和住院患者的菌株865株，其中金黃色葡萄球菌109株，其他葡萄球菌218株，大腸埃希菌139株，其他腸桿菌302株，銅綠假單胞菌26株，其他非發(fā)酵菌71株。采用快速K-B法進行AST，菌株的菌齡分別為≤48 h，72 h，96 h及≥120 h，于進行AST后2 h，2.5 h，3 h，3.5 h和4 h測量抑菌環(huán)改變情況，并進行統(tǒng)計學分析。結果6類細菌的抑菌環(huán)直徑改變率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；相同菌齡的不同菌種抑菌環(huán)直徑改變率差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。相同菌種不同菌齡的菌株抑菌環(huán)直徑改變率差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），不同菌種相同觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變率差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。同一菌種不同觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變率差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。不同菌種的抑菌環(huán)直徑改變率在相同觀測時間的分布差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；而同一菌種的抑菌環(huán)直徑改變率在各觀測時間的分布差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結論細菌抑菌環(huán)直徑的改變率與菌種無關，與菌齡相關，抑菌環(huán)直徑改變對AST判斷結果基本無影響。

快速；K-B法；細菌；抑菌環(huán)；藥物敏感試驗；菌齡

細菌藥物敏感試驗（antibiotic susceptibility test，AST）對臨床合理使用抗生素、細菌耐藥的監(jiān)測以及研究細菌耐藥的機制意義重大。雖然目前許多三級甲等醫(yī)院的臨床微生物實驗室配備了微生物自動鑒定儀，但是，由于其價格昂貴，許多二級甲等醫(yī)院及以下級別醫(yī)院微生物實驗室仍然運用紙片擴散（KB）法進行AST。K-B法獲得AST結果的時間通常為18 h-24 h，不能滿足重癥感染和多重感染患者急需AST結果的需要。本實驗室創(chuàng)建了快速K-B法，在4.2 h內即能夠獲得AST結果。但是，用于AST的細菌的菌齡對抑菌環(huán)直徑有影響，導致AST結果不準確。因此，選擇合適菌齡的菌株進行AST對報告結果的準確性十分重要。本文研究旨在探討常見菌種不同菌齡及不同時間對抑菌環(huán)直徑改變的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2013年1月-2014年9月分離自我院門診和住院患者的菌株共865株，其中金黃色葡萄球菌109株，其他葡萄球菌218株，大腸埃希菌139株，其他腸桿菌科細菌302株，銅綠假單胞菌26株，其他非發(fā)酵菌71株。標本類型為血液、痰液、糞便、尿液、咽拭子、分泌物、白帶、膿液等。

1.2 儀器與試劑使用DL-96Ⅱ型細菌測定系統(tǒng)（珠海迪爾生物工程有限公司生產）進行菌種鑒定。AST紙片和M-H瓊脂平板均為杭州天和微生物試劑有限公司產品，均在有效期內使用。

表1 各種細菌抑菌環(huán)直徑改變率和不同菌齡抑菌環(huán)直徑改變率［n（%）］

1.3 AST快速K-B法AST按照文獻［1］的K-B法進行，采用直接調制菌懸液法制備接種菌液。從2 h開始，用低倍鏡（100倍）每隔0.5 h觀察并測量和記錄抑菌環(huán)直徑，至肉眼能夠觀察到抑菌環(huán)為止；之后每2 h觀察并測量和記錄抑菌環(huán)直徑，至12 h止；至24 h（生長緩慢的細菌則適當延長時間）最終觀察并測量和記錄抑菌環(huán)直徑。用于AST的菌株的菌齡為≤48 h、72 h、96 h、≥120 h。

1.4 結果判斷根據(jù)抑菌環(huán)直徑將AST結果判斷為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R），執(zhí)行試劑生產廠家提供的“產品使用說明書”的判斷標準。

1.5 質控菌株質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853，為杭州天和微生物試劑有限公司生產。質控方法按照文獻［1］進行。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各菌種抑菌環(huán)直徑改變和不同菌齡抑菌環(huán)直徑改變情況在6種常見的菌種中，菌齡為≤48 h、72 h、96 h和≥120 h的同一菌種之間抑菌環(huán)直徑改變率隨著時間的延長逐漸降低，且差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；而不同菌種間相同菌齡的菌株抑菌環(huán)改變率差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），結果見表1。

2.2 6類常見菌種不同觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變情況分別于AST后2 h、2.5 h、3 h、3.5 h及4 h時觀測各菌種出現(xiàn)抑菌環(huán)的菌株數(shù)，至24 h最終觀察并測量記錄所有菌株的抑菌環(huán)直徑改變情況。如表2所示，同一菌種不同時間的抑菌環(huán)直徑改變率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），且觀測時間越短，抑菌環(huán)直徑改變率也越高；而不同菌種相同觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.3 6類常見菌種抑菌環(huán)改變菌株在各觀測時間的分布在觀測時間2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h中，相同菌種在不同觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變率均不相同，且差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；而不同菌種相同時間的抑菌環(huán)直徑改變率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見表3。

3 討論

細菌的耐藥性日趨嚴重，加強細菌耐藥性的監(jiān)測已經迫在眉睫。文獻［2］報道，金黃色葡萄球菌耐藥率最高的前4位青霉素G（87.32%）、紅霉素（87.32%）、苯唑西林（80.28%）、阿奇霉素（76.06%）都大于76%。文獻［3，4］均報道金黃色葡萄球菌有很高的耐藥率。文獻［5］報道，多種細菌有很廣的耐藥譜和很高的耐藥率。這些應引起醫(yī)學界的高度重視?？焖貯ST方法的建立，必將為臨床抗感染治療和減緩細菌耐藥性的產生發(fā)揮積極作用。AST目前有稀釋法和擴散法。稀釋法準確，但操作較復雜；K-B法操作簡便，也有較好的準確性，因此是目前微生物實驗室最常用的AST方法之一。

表2 各觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變率

表3 抑菌環(huán)直徑改變菌株在各觀測時間的分布［n（%）］

快速獲得AST結果是控制感染尤其是控制重癥和多重感染的關鍵。K-B法獲得AST結果的時間較長（通常需要18-24 h），是大部分綜合醫(yī)院棄用該方法而使用自動細菌鑒定儀的主要原因之一。

有文獻［6］報道了快速抗生素敏感試驗方法的建立，該方法雖然快速（6 h時獲得AST結果），但試驗方法操作繁瑣。還有文獻［7，8］報道了用顯色半固體進行快速細菌藥敏試驗的方法，結果顯示在3 h內有96.8%的菌株可得出AST結果，5 h內100%的菌株可得出AST結果，但該試驗方法操作也較繁瑣。

本實驗室建立了“快速K-B法”，3-4 h即可獲得AST結果，快于文獻［6］報道的方法，與文獻［7，8］報道的方法獲得AST結果的時間相近，比自動細菌鑒定儀（6-8 h）也快了許多，且操作簡便，即在標準KB法的基礎上，增加了采用低倍鏡觀測抑菌環(huán)直徑，在細菌接種M-H瓊脂平板，粘貼藥敏紙片孵育后，從2 h開始，每隔0.5 h觀測一次抑菌環(huán)，至肉眼可觀測抑菌環(huán)直徑為止。

但在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)菌株的菌齡對抑菌環(huán)直徑的判讀有影響，因此，本文對醫(yī)院常見菌種的不同菌齡對AST結果的影響進行研究，結果顯示，金黃色葡萄球菌、其他葡萄球菌、大腸埃希菌、其他腸桿菌、銅綠假單胞菌和其他非發(fā)酵菌的抑菌環(huán)直徑改變率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明各種細菌的抑菌環(huán)直徑改變率一致，而相同菌齡的不同菌種抑菌環(huán)直徑改變率差異亦均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），說明細菌抑菌環(huán)直徑改變率不隨菌種的不同而改變；不同菌齡的相同菌種的抑菌環(huán)直徑改變率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），說明細菌的抑菌環(huán)直徑改變率隨著菌齡的不同而改變，菌齡越短的細菌抑菌環(huán)直徑改變率越高（見表1）。由表2可知，不同菌種相同觀測時間出現(xiàn)抑菌環(huán)的菌株抑菌環(huán)直徑改變率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），說明細菌抑菌環(huán)直徑改變率不隨菌種的不同而改變，而同一菌種不同觀測時間出現(xiàn)抑菌環(huán)的菌株抑菌環(huán)直徑改變率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），且在進行AST后2 h時出現(xiàn)抑菌環(huán)的菌株抑菌環(huán)改變率最高（銅綠假單胞菌和其他非發(fā)酵菌除外），說明抑菌環(huán)出現(xiàn)越早（細菌生長越快），其抑菌環(huán)改變率越高。由表3可見，在不同的觀測時間，同一菌種在各觀測時間的抑菌環(huán)直徑改變率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），說明抑菌環(huán)出現(xiàn)越早（細菌生長越快），其抑菌環(huán)改變率越高，觀測時間為3 h以前的抑菌環(huán)直徑改變率占總抑菌環(huán)直徑改變率的近80%。

上述結果表明，不同菌種的抑菌環(huán)直徑改變率近似，細菌抑菌環(huán)直徑的改變率與菌種無關，而與菌齡有關，菌齡越短改變率越高。

然而，細菌抑菌環(huán)直徑改變并不會影響AST的結果判斷。本文研究結果顯示，抑菌環(huán)直徑發(fā)生改變的金黃色葡萄球菌中僅有3.85%（1／26）的菌株抑菌環(huán)直徑改變前的直徑＜23mm，其抑菌環(huán)直徑改變前的判斷結果為“I”，抑菌環(huán)直徑改變后的判斷結果為“S”，AST判讀結果不一致，其余96.15%（25／26）的菌株抑菌環(huán)直徑改變前的直徑≥23mm，其抑菌環(huán)直徑改變前后的AST判讀結果一致（均為S）。此現(xiàn)象可能是因細菌生長較快，而抗菌藥在瓊脂中滲透較慢，隨著抗菌藥的逐漸滲透，藥片遠端瓊脂中的藥物濃度逐漸增大，最初生長的細菌（尚未形成較大菌落）又被抑制或殺死所致。金黃色葡萄球菌中，菌齡≤48 h的菌株的抑菌環(huán)直徑改變率占抑菌環(huán)直徑總改變率（69.23%）明顯高于菌齡較長的菌株（72 h為15.38%，96 h和≥120 h均為7.69%），這是因為菌齡≤48 h的菌株接種M-H瓊脂平板后的生長速度快于菌齡較長的菌株。本文研究結果還顯示，金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑發(fā)生改變的菌株的抑菌環(huán)直徑均為增大，且96.15%的菌株直徑≥23mm，抑菌環(huán)直徑改變前后的AST判讀結果一致（均為S），故不會影響敏感藥物的選擇。其他葡萄球菌、大腸埃希菌、其他腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和其他非發(fā)酵菌的抑菌環(huán)直徑改變前的直徑＜23mm的比例、菌株抑菌環(huán)直徑改變前的直徑≥23mm的比例、菌齡≤48 h菌株的抑菌環(huán)直徑改變率占抑菌環(huán)直徑總改變率分別為4.35%、95.65%、71.74%，3.13%、96.87%、68.75%，3.28%、96.72%、68.85%，0.00%、100.00%、80.00%，0.00%、100.00%、73.33%，與金黃色葡萄球菌的結果近似。所有抑菌環(huán)直徑改變菌株的抑菌環(huán)直徑均為增大，故不會因為抑菌環(huán)直徑的改變而將“S”誤判為“I”或“R”，亦不會影響敏感藥物的選擇。由于菌齡較大的菌株生長緩慢，甚至死亡，會導致獲得AST結果的時間延長，甚至不生長，故應該使用菌齡≤48 h的菌株進行AST。

綜上所述，快速K-B法AST抑菌環(huán)直徑的改變不受菌種影響，受菌齡和觀測時間影響，但影響甚微，基本不影響AST結果判斷，更不會影響敏感藥物的選擇，只要在低倍鏡下可觀測抑菌環(huán)，就可盡早的獲得AST結果。

1 葉應嫵，王毓三，申子瑜，主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程.第3版.南京：東南大學出版社，2006，890-923.

2 李琳，田青友，曹蕾.快速抗生素敏感試驗方法的建立.華北煤炭醫(yī)學院學報，2005，7：280-281.

3 蔣藎芳，周黎.金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析.檢驗醫(yī)學與臨床，2008，5：1501-1502.

4 侯臨平.葡萄球菌的耐藥狀況及克林霉素耐藥株的耐藥表型分析.實用檢驗醫(yī)師雜志，2012，4：104-107.

5 韓蘭芳，方建平.化膿性中耳炎的病原菌及耐藥性分析.國際檢驗醫(yī)學雜志，2008，29：551，553.

6 李先斌，莫麗亞，趙蕊，等.用顯色半固體進行快速細菌藥敏試驗的方法.實用預防醫(yī)學，2006，13：443-444.

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Fast drug sensitive test K－Bmethod bacteriostatic ring diameter change rule and the influence to the judging results

WANG Heng-qiu1，LIU Yu-feng1，WANG Shuang2，etal.1Departmentof Clinical Laboratory，Shaoguan City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shaoguan 512031，China2Department of Cardiology，Shaoguan City Hospitalof Traditional Chinese Medicine，Shaoguan 512031，China

ObjectiveTo explore rapid K-Bmethod，antibiotic susceptibility test（AST）bacteriostatic ring diameter change rule and the influence to the judging results.Methods865 strains bacteria were collected from outpatients and inpatients in our hospital from January 2013 to September 2014.Including 109 strainsStaphylococcus aureus，218 strains other Staphylococcus，139 strains Escherichia coli，302 strains other Enteric bacilli，26 strainsPseudomonas aeruginosaand 71 strains other non-fermenting bacteria.AST were detected by fastK-Bmethod.The cellage ofbacteriawere≤48 h，72 h，96 h and≥120 h，respectively.Bacterial inhibition ringweremesured in 2 h，2.5 h，3 h，3.5 h and 4 h after AST，and alldataanalyzed statistically.ResultsThe differenceofbacterial inhibition ring change rates in 6 kindsofbacteria had no statisticalsignificance（P＞0.05）.The differencesofbacterial inhibition ring change rates in differentstrainsofsame cellage allhad no statisticalsignificance（P all＞0.05）.The differencesofbacterial inhibition ring change rates ofdifferentcellage in same strainsallhad statisticalsignificance（P all＜0.05）.At the same observation time，the differences of bacterial inhibition ring change rates in different strains all had no statistical significance（P all＞0.05）.At different observation time，the differences of bacterial inhibition ring change rates in same strainsallhad statisticalsignificance（P all＜0.05）.At the same observation time，the distribution differences of bacterial inhibition ring change rates in differentstrainsallhad no statisticalsignificance（P all＞0.05）.Atdifferentobservation time，the distribution differences ofbacterial inhibition ring change rates in the same strains allhad statisticalsignificance（P all＜0.05）.ConclusionBacteria bacteriostatic ring diameter change rate has no correlation with the strain，buthas correlation with cell age.Bacteriostatic ring diameter can not influence the judging resultsofAST.

Quickly；K-Bmethod；Bacteria；Bacteriostatic ring；Drug sensitive test；Cellage

10.3969／j.issn.1674－7151.2014.04.008

2014-09-28）

（本文編輯：李霦）

2014年韶關市科技計劃（醫(yī)學類）項目（2014CX／Ka07）

512031 韶關市，韶關市中醫(yī)院檢驗科1，心內科2