張 超，陳文兵，武道吉，魏天迪

（1. 山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟南 250101；2.山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 濟南 250100）

石油及其制品在生產(chǎn)、加工、運輸和使用過程中產(chǎn)生的大量石油污染物進入環(huán)境，對土壤造成了嚴(yán)重污染，因此對石油污染土壤的治理已迫在眉睫［1-2］。石油污染土壤治理技術(shù)中，與物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，微生物修復(fù)技術(shù)因其修復(fù)效果好、操作簡便、費用低、降解過程迅速和無二次污染等特點，被廣泛采用［3］。微生物修復(fù)技術(shù)的本質(zhì)是通過微生物的代謝活動將污染物降解，修復(fù)過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復(fù)效果，還需引入馴化的高效石油降解菌［4］。

相比于正交設(shè)計，均勻設(shè)計的主要優(yōu)勢是：在因素和水平數(shù)均較多的情況下，用較少的實驗次數(shù)就可獲得期望的結(jié)果，節(jié)省人力和物力，便于實施［5］。目前，國內(nèi)還少見將均勻設(shè)計法用于石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的研究報道。

本工作采用從東營石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對模擬石油污染土壤進行微生物修復(fù)。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并進一步從理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量方面比較了土壤經(jīng)微生物修復(fù)前后的變化，為東營石油污染土壤微生物修復(fù)的現(xiàn)場應(yīng)用提供了技術(shù)參考和理論支持。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

原油：山東省東營市某煉油廠；土壤：山東省東營市東營未受污染的淺層（5～25 cm）土壤。土壤經(jīng)破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質(zhì)量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲存在滅菌牛皮紙袋內(nèi)冷藏備用。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15 g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節(jié)細菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實驗室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。

PHS-3型酸度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；721型可見光分光光度計：北京光學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 4種單菌與土著微生物石油降解率的比較

采用LB培養(yǎng)基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50 g分別裝入80個錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個。取其中4組分別以50.0 mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28 ℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對照樣考察土著微生物的修復(fù)作用。每間隔一段時間取樣，采用重量法測定土壤試樣中石油的含量［6］，計算石油降解率。

1.2.2 優(yōu)勢菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定

對4種菌進行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0 mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28 ℃的恒溫箱中放置40 d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率，從而構(gòu)建出優(yōu)勢菌群。采用均勻設(shè)計法對優(yōu)勢菌群的配比進行優(yōu)化。

1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗

選取5個影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設(shè)計考察各因素對修復(fù)效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40 d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定方法

采用電位法測定土樣pH，水與土的體積比為2.5；重鉻酸鉀容量法測定模擬土樣的有機質(zhì)含量［7］；半微量凱氏法測定模擬土樣的總氮含量［8］；鉬銻抗比色法測定模擬土樣的總磷含量［9］。

1.3.2 土壤酶活性及微生物種群數(shù)量的測定

采用TTC法測定模擬土樣中脫氫酶的活性［10］，奈氏比色法測定脲酶的活性［11］，鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶的活性［12］，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶的活性［13］；采用菌落形成單位CFU計數(shù)測定土壤的微生物種群數(shù)量［13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種單菌與土著微生物對石油降解率的影響

4種單菌與土著微生物對石油降解率的影響見圖1。由圖1可見：使用4種單菌時石油降解率的高低順序為D>C>A>B，且均高于土著微生物；D菌處理40 d后，石油降解率達30.08%，而土著微生物處理40 d培養(yǎng)后的石油降解率僅為5.02%。

圖1 4種單菌與土著微生物對石油降解率的影響

2.2 優(yōu)勢菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定

混合菌的配比對石油降解率的影響見表1。由表1可見，當(dāng)A，B，C，D 4種菌混合使用時，石油 降解率最高，達到40.02%。

表1 混合菌的配比對石油降解率的影響

采用U11（114）均勻設(shè)計表進行實驗，確定A，B，C，D 4種菌的最佳配比。U11（114）均勻設(shè)計的實驗方案和結(jié)果見表2，其中：X1為A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X2為B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X3為C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X4為D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表2 U11（114）均勻設(shè)計的實驗方案和結(jié)果

U11（114）均勻?qū)嶒灥臄?shù)據(jù)處理采用Uniform Design 2.10軟件，得出回歸方程見式（1）。

方差分析表中顯著性水平為0.009<0.01，回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的。混合菌的最佳配比為：X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%，預(yù)測最高石油降解率為54.30%。在最佳配比條件下進行驗證實驗，石油降解率為54.50%，與預(yù)測結(jié)果的誤差為0.37%。實驗值與預(yù)測值的誤差在允許范圍之內(nèi)，說明均勻設(shè)計優(yōu)化的菌種配比準(zhǔn)確可信。

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗

采用U14（148）均勻設(shè)計表進行實驗，研究各培養(yǎng)條件對石油降解率的影響。U14（148）均勻設(shè)計的實驗方案和結(jié)果見表3。其中：U1為混合菌接種量，U2為土壤含水率，U3為雞糞加入量，U4為麥糠加入量，U5為表面活性劑加入量。

表3 U14（148）均勻設(shè)計的實驗方案和結(jié)果

U14（148）均勻?qū)嶒灁?shù)據(jù)的處理采用Uniform Design 2.10軟件，得出回歸方程見式（2）。

方差分析表中顯著性水平為0.001<0.01，回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的。菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：混合菌接種量122.0 mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90 g/kg、麥糠加入量150 g/kg和表面活性劑加入量22 mL/kg，預(yù)測最高石油降解率為67.35%。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進行驗證實驗，石油降解率為66.95%，與預(yù)測結(jié)果的誤差為0.59%。實驗值與預(yù)測值的誤差在允許范圍之內(nèi)，說明均勻設(shè)計優(yōu)化的菌群培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可信。

2.4 微生物修復(fù)前后土壤性質(zhì)的對比

分別將未經(jīng)處理的模擬土樣、經(jīng)土著微生物通風(fēng)堆肥法處理的模擬土樣、經(jīng)混合菌處理（最佳配比及最優(yōu)培養(yǎng)條件下）的模擬土樣記作M1，M2，M3，考察微生物修復(fù)前后土壤理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量的變化。經(jīng)過不同處理的模擬土樣的性質(zhì)見表4。

表4 經(jīng)過不同處理的模擬土樣的性質(zhì)

由表4可見，M3的修復(fù)效果最好，石油降解率達66.95%，而M2的石油降解率僅為5.02%。由于M3在修復(fù)過程中投入了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因此土樣中有機質(zhì)和總氮含量大幅提高；而M2的各指標(biāo)變化則不如M3的明顯。M3中脫氫酶和過氧化氫酶活性最高，這是由于在修復(fù)過程中土壤微生物大量繁殖，微生物參與了石油烴的降解過程，使得脫氫酶和過氧化氫酶活性提高。M3中的脲酶活性最高，說明土壤的氮元素轉(zhuǎn)化能力強，有利于土壤中微生物的生長，為微生物參與石油烴的降解提供了充足的營養(yǎng)條件。而M2中各種酶活性的變化均不如M3中明顯。M3在細菌、放線菌和真菌的數(shù)量方面均明顯高于M1和M2，接近于自然界中實際的微生物數(shù)量。

3 結(jié)論

a）實驗室保藏的A，B，C，D 4種高效石油降解菌均可提高微生物修復(fù)石油污染土壤的效果。單菌在40 d修復(fù)過程中的修復(fù)效果遠遠超出土著微生物，且4種單菌石油降解率的高低順序為：D>C>A>B。

b）4種菌混合除油的效果最好，在最佳配比（X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%）條件下，40 d后土壤的石油降解率達54.50%。

c）菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：混合菌接種量122.0 mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90 g/kg、麥糠加入量150 g/kg和表面活性劑加入量22 mL/kg；在此條件下，40 d后土壤的石油降解率達66.95%。

d）經(jīng)混合菌修復(fù)的石油污染土壤，其肥力明顯升高，脫氫酶、過氧化酶和脲酶的活性均升高，微生物數(shù)量也有明顯增加。

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